(一)技术领域
本发明涉及一种脱氧次黄嘌呤在脱氧寡核苷酸链连接反应中的应用。
(二)背景技术
由任意序列寡脱氧核苷酸组成的寡脱氧核苷酸文库(oligonucleotide libraries)已被广泛地应 用于测序、突变体诊断、基因表达和微生物鉴定。但是，寡脱氧核苷酸文库的应用中有一个明显 的不足之处，就是随着寡脱氧核苷酸链上碱基数的增加，文库按4倍比率(4N，N为寡脱氧核苷 酸链上碱基数)迅速变大，如8个碱基长的寡脱氧核苷酸全文库就包含65536(48)种寡脱氧核 苷酸链，从而导致：①难合成，尤其是长链寡脱氧核苷酸文库；②成本很高。为此，研究人员通 过缩短寡脱氧核苷酸链长度来减小文库。但是，人们发现这样做有一些缺点，如杂交稳定性差、 难区分末端错配等。有研究发现，既能减小文库又能克服以上这些缺点的一种比较有效的方法是 在寡核苷酸链上加入通用碱基(universal base)，因通用碱基均能同4种常见碱基(鸟嘌呤即G、 腺嘌呤即A、尿嘧啶即U和胞嘧啶即C)进行碱基配对，所以可以在不缩短寡脱氧核苷酸链的前 提下，减小寡脱氧核苷酸文库。
除鸟嘌呤(G)、腺嘌呤(A)、尿嘧啶(U)和胞嘧啶(C)4种自然碱基外，次黄嘌呤(I) 被发现存在于一些tRNAs的反义密码子(anticode)的第三位碱基的摆动性位置(wobble position) 上，能够与mRNAs密码子上的腺嘌呤、胞嘧啶和尿嘧啶进行碱基互补配对。脱氧次黄嘌呤已作 为通用碱基被成功加入到引物中用于PCR反应的DNA扩增及测序。还有报道说在PCR扩增反应 时，当三种三磷酸脱氧核糖核苷酸浓度正常而第四种三磷酸脱氧核糖核苷酸浓度比较低时，三磷 酸脱氧次黄嘌呤核苷酸能够被聚合酶所识别而纳入到PCR产物中去。但是，到目前为止，通用碱 基加入到寡脱氧核苷酸链而进行连接反应的相关研究工作还很少。已有研究发现当其他通用碱基 3-硝基吡咯和5-硝基吡咯处在寡脱氧核苷酸链的5’-末端或3’-末端时，它们不能被T4DNA连接 酶所识别。Luo等研究发现，当通用碱基3-硝基吡咯处于3’-末端附近时(仍然处于连接酶的活性 位置)，它能够被Tth DNA连接酶所识别，并能提高连接反应的保真度。除了硝基吡咯，还没有 对通用碱基脱氧次黄嘌呤在连接反应中的应用进行过研究和报道。而且，有别于硝基吡咯的很难 被掺入到寡脱氧核苷酸链中，通用碱基脱氧次黄嘌呤很容易被掺入合成到寡脱氧核苷酸链中，现 已有国内外多家公司能提供这方面的服务和技术支持，如美国的Integrated DNA Technologies (IDT)、国内的生工生物工程(上海)有限公司等，这为将脱氧次黄嘌呤作为通用碱基应用到连 接反应提供了极大的可能性。本发明提供了一种对寡核苷酸链上不同碱基位置用脱氧次黄嘌呤进 行单替代或多替代，并应用于连接反应的方法。
(三)发明内容
本发明目的是提供一种在寡脱氧核苷酸链上不同的碱基位置用通用碱基脱氧次黄嘌呤进行单 位点或多位点替换，并将之应用于寡脱氧核苷酸链连接反应。
本发明采用的技术方案是：
脱氧次黄嘌呤在脱氧寡核苷酸链连接反应中的应用，所述的应用为：脱氧次黄嘌呤I作为通用 碱基对脱氧寡核苷酸单链中的碱基进行单位点替代或多位点替代，并与被替代脱氧寡核苷酸单链 的互补链进行碱基配对，形成脱氧寡核苷酸双链。
所述单位点替代为下列之一：(1)脱氧次黄嘌呤I在脱氧寡核苷酸单链连接位点处的第3个 碱基位点及第3个碱基位点以上的位点替代腺嘌呤A、胸腺嘧啶T、鸟嘌呤G或胞嘧啶C；(2) 脱氧次黄嘌呤I在脱氧寡核苷酸单链连接位点处的第2个碱基位替代鸟嘌呤G或胞嘧啶C；(3) 脱氧次黄嘌呤I在脱氧寡核苷酸单链连接位点处的第1个碱基位替代鸟嘌呤G。
所述多位点替代为双位点替代，所述双位点替代为下列之一：1)脱氧次黄嘌呤I在脱氧寡核 苷酸单链连接位点处的第3和第4个碱基位替代胸腺嘧啶T；2)脱氧次黄嘌呤I在脱氧寡核苷酸 单链连接位点旁边的第3和第5个碱基位替代胸腺嘧啶T；3)脱氧次黄嘌呤I在脱氧寡核苷酸单 链连接位点旁边的第4和第5个碱基位替代胸腺嘧啶T、腺嘌呤A或胞嘧啶C中的一种。
所述多位点替代为三位点替代，所述三位点替代为脱氧次黄嘌呤I在脱氧寡核苷酸单链连接 位点旁边的第3、第4和第5个碱基位替代鸟嘌呤G。
进一步，所述的脱氧次黄嘌呤在脱氧寡核苷酸链连接反应中的应用推荐按如下步骤进行：(1) 脱氧次黄嘌呤替代的寡核苷酸单链：连接位点第0～5位依次用脱氧次黄嘌呤进行单位点或多位点 替代，并人工合成碱基位点被脱氧次黄嘌呤替代的寡核苷酸单链；(2)连接反应：将10μl含终 浓度均为1μM的三条不同的寡核苷酸单链的混合液，在95℃下处理5min后，以1℃/min的速 率降温到10℃进行杂交，然后加入10μl的连接液，在10～30℃下连接5～900min，紧接着在 65℃下处理15min终止连接反应；(3)电泳检测：然后用10％的聚丙烯酰胺凝胶电泳观察连接 结果，所述连接液为下列物质的混合液：66mM的三羟甲基胺基甲烷-盐酸(pH7.6)、10mM的 氯化镁、1mM的二硫苏糖醇、7.5％的PEG 6000、1mMATP和1～10U的Quick T4连接酶，所 述三条不同的寡核苷酸单链为寡核苷酸单链、碱基位点被脱氧次黄嘌呤替代的单链和与被替代的 寡核苷酸单链互补的单链。
进一步，本发明所述的单位点替代为：
(1)脱氧次黄嘌呤I在脱氧寡核苷酸单链连接位点旁边的第0～5个碱基位点替代胞嘧啶C： 本发明所述脱氧寡核苷酸单链都是从Integrated DNA Technologies公司合成，另有说明的除外，所 述碱基A、T、G、C分别为腺嘌呤A、胸腺嘧啶T、尿嘧啶G和胞嘧啶C：
①17个碱基长的5’-末端磷酸化的特异性寡脱氧核苷酸链：
5’Phos-TE17：5’pATCGAAGAGCTGAGGCG3’；
②23个碱基长的特异性寡脱氧核苷酸链：
BP23-6G：5’CGCCTCAGCTCTTCGATGGGGGG3’；
③30个碱基长且没有掺入脱氧次黄嘌呤I的特异性寡脱氧核苷酸链：
SST30B6C：5’GTTCTAGAATCTTGATCACCCTACCCCCC3’；
SST30B6C的第25、26、27、28、29、30位碱基C被脱氧次黄嘌呤I替代的寡脱氧核苷酸链分别 为：
④SST30B-5I5C：5’GTTCTAGAATCTTGATCACGCCTAICCCCC3’；
⑤SST30B1C-4I4C：5’GTTCTAGAATCTTGATCACGCCTACICCCC3’；
⑥SST30B2C-3I3C：5’GTTCTAGAATCTTGATCACGCCTACCICCC3’；
⑦SST30B3C-2I2C：5’GTTCTAGAATCTTGATCACGCCTACCCICC3’；
⑧SST30B4C-1I1C：5’GTTCTAGAATCTTGATCACGCCTACCCCIC3’；
⑨SST30B5C0I：5’GTTCTAGAATCTTGATCACGCCTACCCCCI3’；
单链5’Phos-TE17和单链BP23-6G经常规杂交反应后，能互补匹配形成双链杂合体 (5’Phos-TE17-BP23-6G)，此杂合体一边为平末端，另一边是一个6个G(polyG6)的粘末端(6 个G的单链)。
5’Phos-TE17-BP23-6G与SST30B6C混合并加入Quick T4连接酶，5’Phos-TE17-BP23-6G末 端的6个G能与SST30B6C的3’末端的6个C互补匹配，从而，5’Phos-TE17-BP23-6G与SST30B6C 能被连接起来，如图2的A中2所示，在聚丙烯酰胺凝胶上形成40～50bps(base pairs)的清晰 条带，若不加入连接酶(图2的A中1所示)，在40～50bps位置没有相应条带；
5’Phos-TE17-BP23-6G与SST30B-5I5C混合并加入Quick T4连接酶，5’Phos-TE17-BP23-6G 末端的6个G能与SST30B-5I5C的3’末端的5个C和1个I互补匹配，如图2的A中3所示， 在聚丙烯酰胺凝胶上也形成40～50bps的清晰条带，说明5’Phos-TE17-BP23-6G与SST30B-5I5C 能被连接起来，而且与阳性对照(SST30B6C，即没有脱氧次黄嘌呤I替代)相比，连接产物浓度 基本一致，由此说明在连接位点旁边5位(“-5”)有I:G配对不影响Quick T4连接酶的连接作用；
5’Phos-TE17-BP23-6G与SST30B1C-4I4C混合并加入Quick T4连接酶，5’Phos-TE17-BP23-6G 末端的6个G能与SST30B1C-4I4C的3’末端的4个C、1个I和1个C互补匹配，如图2的A 中4所示，在聚丙烯酰胺凝胶上也形成40～50bps的清晰条带，说明5’Phos-TE17-BP23-6G与 SST30B1C-4I4C能被连接起来，而且与阳性对照(SST30B6C，即没有脱氧次黄嘌呤I替代)相 比，连接产物浓度基本一致，由此说明在连接位点旁边4位(“-4”)有I:G配对不影响Quick T4连 接酶的连接作用；
5’Phos-TE17-BP23-6G与SST30B2C-3I3C混合并加入Quick T4连接酶，5’Phos-TE17-BP23-6G 末端的6个G能与SST30B2C-3I3C的3’末端的3个C、1个I和2个C互补匹配，如图2的A 中5所示，在聚丙烯酰胺凝胶上也形成40～50bps的清晰条带，说明5’Phos-TE17-BP23-6G与 SST30B2C-3I3C能被连接起来，而且与阳性对照(SST30B6C，即没有脱氧次黄嘌呤I替代)相 比，连接产物浓度基本一致，由此说明在连接位点旁边3位(“-3”)有I:G配对不影响Quick T4连 接酶的连接作用；
5’Phos-TE17-BP23-6G与SST30B3C-2I2C混合并加入Quick T4连接酶，5’Phos-TE17-BP23-6G 末端的6个G能与SST30B3C-2I2C的3’末端的2个C、1个I和3个C互补匹配，如图2的A 中6所示，在聚丙烯酰胺凝胶上也形成40～50bps的清晰条带，说明5’Phos-TE17-BP23-6G与 SST30B3C-2I2C能被连接起来，而且与阳性对照(SST30B6C，即没有脱氧次黄嘌呤I替代)相 比，连接产物浓度基本一致，由此说明在连接位点旁边2位(“-2”)有I:G配对不影响Quick T4连 接酶的连接作用；
5’Phos-TE17-BP23-6G与SST30B4C-1I1C混合并加入Quick T4连接酶，5’Phos-TE17-BP23-6G 末端的6个G能与SST30B4C-1I1C的3’末端的1个C、1个I和4个C互补匹配，如图2的A 中7所示，在聚丙烯酰胺凝胶上也形成40～50bps的清晰条带，说明5’Phos-TE17-BP23-6G与 SST30B4C-1I1C能被连接起来，而且与阳性对照(SST30B6C，即没有脱氧次黄嘌呤I替代)相 比，连接产物浓度基本一致，由此说明在连接位点旁边1位(“-1”)有I:G配对不影响Quick T4连 接酶的连接作用；
5’Phos-TE17-BP23-6G与SST30B5C0I混合并加入Quick T4连接酶，5’Phos-TE17-BP23-6G 末端的6个G与SST30B5C0I的3’末端的1个I和5个C互补，如图2的A中8所示，在聚丙烯 酰胺凝胶上形成了40～50bps大小的较淡条带，说明只有很少量的5’Phos-TE17-BP23-6G与 SST30B5C0I能被连接起来，由此说明在连接位点(“0”)有I:G配对的话会极大地影响Quick T4连 接酶的连接作用；
综上所述，可见，只有“0”位，即发生连接反应的位点有I:G配对会极大地影响Quick T4连 接酶的连接作用，而其他位置(“-5”～“-1”)的I:G配对均没有影响。
(2)脱氧次黄嘌呤I在脱氧寡核苷酸单链连接位点旁边的第0～5个碱基位点替代胸腺嘧啶 T：
①17个碱基长的5’-末端磷酸化的特异性寡脱氧核苷酸链：
5’Phos-TE 17：5’pATCGAAGAGCTGAGGCG3’；
②23个碱基长的特异性寡脱氧核苷酸链：
BP23-6A：5’CGCCTCAGCTCTTCGATAAAAAA3’；
③30个碱基长且没有掺入脱氧次黄嘌呤的特异性寡脱氧核苷酸链：
SST30B6T：5’GTTCTAGAATCTTGATCACGCCTATTTTTT3’；
④SST30B6T的第25位碱基T被脱氧次黄嘌呤I替代的寡脱氧核苷酸链：SST30B-5I5T：5’ GTTCTAGAATCTTGATCACGCCTAITTTTT3’；
⑤SST30B6T第26位碱基T被脱氧次黄嘌呤I替代的寡脱氧核苷酸链：SST30B1T-4I4T：5’ TTCTAGAATCTTGATCACGCCTATITTTT3’；
⑥SST30B6T第27位碱基T被脱氧次黄嘌呤I替代的寡脱氧核苷酸链：SST30B2T-3I3T：5’ GTTCTAGAATCTTGATCACGCCTATTITTT3’；
⑦SST30B6T第28位碱基T被脱氧次黄嘌呤I替代的寡脱氧核苷酸链：SST30B3T-2I2T：5’ GTTCTAGAATCTTGATCACGCCTATTTITT3’；
⑧SST30B6T第29位碱基T被脱氧次黄嘌呤I替代的寡脱氧核苷酸链：SST30B4T-1I1T：5’ GTTCTAGAATCTTGATCACGCCTATTTTIT3’；
⑨SST30B6T第30位碱基T被脱氧次黄嘌呤I替代的寡脱氧核苷酸链：SST30B5T0I：5’ GTTCTAGAATCTTGATCACGCCTATTTTTI3’；
单链5’Phos-TE17和单链BP23-6A经常规杂交反应后，能互补匹配形成双链杂合体(5’ Phos-TE17-BP23-6A)，此杂合体一边为平末端，另一边是一个6个A(polyA6)的粘末端(6个 A的单链)。
①5’Phos-TE17-BP23-6A与SST30B6T混合并加入Quick T4连接酶，5’Phos-TE17-BP23-6A 末端的6个A能与SST30B6T的3’末端的6个T互补匹配，从而，5’Phos-TE17-BP23-6A与 SST30B6T能被连接起来，如图2的B中2所示，在聚丙烯酰胺凝胶上形成40～50bps的清晰条 带，若不加入连接酶(图2的B中1所示)，在40～50bps位置没有相应条带；
②5’Phos-TE17-BP23-6A与SST30B-5I5T混合并加入Quick T4连接酶，5’ Phos-TE17-BP23-6A末端的6个A能与SST30B-5I5T的3’末端的5个T和1个I互补匹配，如 图2的B中3所示，在聚丙烯酰胺凝胶上也形成40～50bps的清晰条带，说明5’Phos-TE17-BP23-6A 与SST30B-5I5T能被连接起来，而且与阳性对照(SST30B6T，即没有脱氧次黄嘌呤I替代)相 比，连接产物浓度基本一致，由此说明在连接位点旁边5位(“-5”)有I:A配对不影响Quick T4 连接酶的连接作用；
③5’Phos-TE17-BP23-6A与SST30B1T-4I4T混合并加入Quick T4连接酶，5’ Phos-TE17-BP23-6A末端的6个A能与SST30B1T-4I4T的3’末端的4个T、1个I和1个T互 补匹配，如图2的B中4所示，在聚丙烯酰胺凝胶上也形成40～50bps的清晰条带，说明5’ Phos-TE17-BP23-6A与SST30B1T-4I4T能被连接起来，而且与阳性对照(SST30B6T，即没有脱 氧次黄嘌呤I替代)相比，连接产物浓度基本一致，由此说明在连接位点旁边4位(“-4”)有I:A 配对不影响Quick T4连接酶的连接作用；
④5’Phos-TE17-BP23-6A与SST30B2T-3I3T混合并加入Quick T4连接酶，5’ Phos-TE17-BP23-6A末端的6个A能与SST30B2T-3I3T的3’末端的3个T、1个I和2个T互 补匹配，如图2的B中5所示，在聚丙烯酰胺凝胶上也形成40～50bps的清晰条带，说明5’ Phos-TE17-BP23-6A与SST30B2T-3I3T能被连接起来，而且与阳性对照(SST30B6T，即没有脱 氧次黄嘌呤I替代)相比，连接产物浓度基本一致，由此说明在连接位点旁边3位(“-3”)有I:A 配对不影响Quick T4连接酶的连接作用；
⑤5’Phos-TE17-BP23-6A与SST30B3T-2I2T混合并加入Quick T4连接酶，5’ Phos-TE17-BP23-6A末端的6个A能与SST30B3T-2I2T的3’末端的2个T、1个I和3个T互 补匹配，如图2的B中6所示，在聚丙烯酰胺凝胶上也形成40～50bps的清晰条带，说明5’ Phos-TE17-BP23-6A与SST30B3T-2I2T能被连接起来；与阳性对照(SST30B6T，即没有脱氧次 黄嘌呤I替代)相比，连接产物浓度有所下降，由此说明在连接位点旁边2位(“-2”)有I:A配对 会对Quick T4连接酶的连接作用有一定的负面影响，但不会完全抑制连接酶活性；
⑥5’Phos-TE17-BP23-6A与SST30B4T-1I1T混合并加入Quick T4连接酶，5’ Phos-TE17-BP23-6A末端的6个A能与SST30B4T-1I1T的3’末端的1个T、1个I和4个T互 补匹配，如图2的B中7所示，在聚丙烯酰胺凝胶上也形成40～50bps的清晰条带，说明5’ Phos-TE17-BP23-6A与SST30B4T-1I1T能被连接起来，与阳性对照(SST30B6T，即没有脱氧次 黄嘌呤I替代)相比，连接产物浓度有明显下降，由此说明在连接位点旁边1位(“-1”)有I:A配 对会对Quick T4连接酶的连接作用有一定的负面影响；与“-2”I:A配对相比，影响变强，但仍 然不会完全抑制连接酶活性；
⑦5’Phos-TE17-BP23-6A与SST30B5T0I混合并加入Quick T4连接酶，5’ Phos-TE17-BP23-6A末端的6个A与SST30B5T0I的3’末端的1个I和5个T互补，如图2的B 中8所示，在聚丙烯酰胺凝胶上没有形成40～50bps大小的较淡条带，说明5’Phos-TE17-BP23-6A 与SST30B5T0I不能被连接起来，由此说明在连接位点(“0”)有I:A配对会完全抑制了Quick T4 连接酶的连接作用；
综上所述，可见，在连接位点旁边第3位(“-3”)及以上有I:A配对不会影响Quick T4连接 酶的连接作用；“-2”和“-1”位有I:A配对会部分影响Quick T4连接酶的连接作用；而“0”位 有I:A配对会完全抑制Quick T4连接酶的连接作用。
(3)脱氧次黄嘌呤I在脱氧寡核苷酸单链连接位点旁边的第0～5个碱基位点替代腺嘌呤A：
①17个碱基长的5’-末端磷酸化的特异性寡脱氧核苷酸链：
5’Phos-TE 17：5’pATCGAAGAGCTGAGGCG3’；
②23个碱基长的特异性寡脱氧核苷酸链：
BP23-6T：5’CGCCTCAGCTCTTCGATTTTTTT3’；
③30个碱基长且没有掺入脱氧次黄嘌呤的特异性寡脱氧核苷酸链：
SST30B6A：5’GTTCTAGAATCTTGATCACGCCTAAAAAAA3’；
④SST30B6A的第25位碱基A被脱氧次黄嘌呤I替代的寡脱氧核苷酸链：SST30B-5I5A：5’ GTTCTAGAATCTTGATCACGCCTAIAAAAA3’；
⑤SST30B6A第26位碱基A被脱氧次黄嘌呤I替代的寡脱氧核苷酸链：SST30B1A-4I4A：5’ GTTCTAGAATCTTGATCACGCCTAAIAAAA3’；
⑥SST30B6A第27位碱基A被脱氧次黄嘌呤I替代的寡脱氧核苷酸链：SST30B2A-3I3A：5’ GTTCTAGAATCTTGATCACGCCTAAAIAAA3’；
⑦SST30B6A第28位碱基A被脱氧次黄嘌呤I替代的寡脱氧核苷酸链：SST30B3A-2I2A：5’ GTTCTAGAATCTTGATCACGCCTAAAAIAA3’；
⑧SST30B6A第29位碱基A被脱氧次黄嘌呤I替代的寡脱氧核苷酸链：SST30B4A-1I1A：5’ GTTCTAGAATCTTGATCACGCCTAAAAAIA3’；
⑨SST30B6A第30位碱基C被脱氧次黄嘌呤I替代的寡脱氧核苷酸链：SST30B5A0I：5’ GTTCTAGAATCTTGATCACGCCTAAAAAAI3’；
单链5’Phos-TE17和单链BP23-6T经常规杂交反应后，能互补匹配形成双链杂合体(5’ Phos-TE17-BP23-6T)，此杂合体一边为平末端，另一边是一个6个T(polyT6)的粘末端(6个T 的单链)。
①5’Phos-TE17-BP23-6T与SST30B6A混合并加入Quick T4连接酶，5’Phos-TE17-BP23-6T 末端的6个T能与SST30B6A的3’末端的6个A互补匹配，从而，5’Phos-TE17-BP23-6T与 SST30B6A能被连接起来，如图2的C中2所示，在聚丙烯酰胺凝胶上形成40～50bps的清晰条 带，若不加入连接酶(图2的C中1所示)，在40～50bps位置没有相应条带；
②5’Phos-TE17-BP23-6T与SST30B-5I5A混合并加入Quick T4连接酶，5’ Phos-TE17-BP23-6T末端的6个T能与SST30B-5I5A的3’末端的5个A和1个I互补匹配，如 图2的C中3所示，在聚丙烯酰胺凝胶上也形成40～50bps的清晰条带，说明5’Phos-TE17-BP23-6T 与SST30B-5I5A能被连接起来，而且与阳性对照(SST30B6A，即没有脱氧次黄嘌呤I替代)相 比，连接产物浓度基本一致，由此说明在连接位点旁边5位(“-5”)有I:T配对不影响Quick T4 连接酶的连接作用；
③5’Phos-TE17-BP23-6T与SST30B1A-4I4A混合并加入Quick T4连接酶，5’ Phos-TE17-BP23-6T末端的6个T能与SST30B1A-4I4A的3’末端的4个A、1个I和1个A互 补匹配，如图2的C中4所示，在酰胺聚丙烯凝胶上也形成40～50bps的清晰条带，说明5’ Phos-TE17-BP23-6T与SST30B1A-4I4A能被连接起来，而且与阳性对照(SST30B6A，即没有脱 氧次黄嘌呤I替代)相比，连接产物浓度基本一致，由此说明在连接位点旁边4位(“-4”)有I:T 配对不影响Quick T4连接酶的连接作用；
④5’Phos-TE17-BP23-6T与SST30B2A-3I3A混合并加入Quick T4连接酶，5’ Phos-TE17-BP23-6T末端的6个T能与SST30B2A-3I3A的3’末端的3个A、1个I和2个A互 补匹配，如图2的C中5所示，在酰胺聚丙烯凝胶上也形成40～50bps的清晰条带，说明5’ Phos-TE17-BP23-6T与SST30B2A-3I3A能被连接起来，而且与阳性对照(SST30B6A，即没有脱 氧次黄嘌呤I替代)相比，连接产物浓度基本一致，由此说明在连接位点旁边3位(“-3”)有I:T 配对不影响Quick T4连接酶的连接作用；
⑤5’Phos-TE17-BP23-6T与SST30B3A-2I2A混合并加入Quick T4连接酶，5’ Phos-TE17-BP23-6T末端的6个T能与SST30B3A-2I2A的3’末端的2个A、1个I和3个A互 补匹配，如图2的C中6所示，在酰胺聚丙烯凝胶上也形成40～50bps的清晰条带，说明5’ Phos-TE17-BP23-6T与SST30B3A-2I2A能被连接起来，而且与阳性对照(SST30B6A，即没有脱 氧次黄嘌呤I替代)相比，连接产物浓度基本一致，由此说明在连接位点旁边2位(“-2”)有I:T 配对不影响Quick T4连接酶的连接作用；
⑥5’Phos-TE17-BP23-6T与SST30B4A-1I1A混合并加入Quick T4连接酶，5’ Phos-TE17-BP23-6T末端的6个T能与SST30B4A-1I1A的3’末端的1个A、1个I和4个A互 补匹配，如图2的C中7所示，在酰胺聚丙烯凝胶上也形成40～50bps的清晰条带，说明5’ Phos-TE17-BP23-6T与SST30B4A-1I1A能被连接起来，与阳性对照(SST30B6A，即没有脱氧次 黄嘌呤I替代)相比，连接产物浓度有所下降，由此说明在连接位点旁边1位(“-1”)有I:T配对 在一定程度上影响Quick T4连接酶的连接作用，但不会完全一致连接酶活力；
⑦5’Phos-TE17-BP23-6T与SST30B5A0I混合并加入Quick T4连接酶，5’ Phos-TE17-BP23-6T末端的6个T与SST30B5A0I的3’末端的1个I和5个A互补，如图2的C 中8所示，在聚丙烯酰胺凝胶上基本没有形成40～50bps大小的条带，说明5’Phos-TE17-BP23-6T 与SST30B5A0I基本没有被连接起来，由此说明在连接位点(“0”)有I:T配对的话会极大地影响 Quick T4连接酶的连接作用；
综上所述，可见，在连接位点旁边第2位(“-2”)及以上有I:T配对不会影响Quick T4连接 酶的连接作用；“-1”位有I:T配对会部分影响Quick T4连接酶的连接作用；而“0”位有I:T 配对会基本完全抑制Quick T4连接酶的连接作用。
(4)脱氧次黄嘌呤I在脱氧寡核苷酸单链连接位点旁边的第0～5个碱基位点替代鸟嘌呤G：
①17个碱基长的5’-末端磷酸化的特异性寡脱氧核苷酸链：
5’Phos-TE 17：5’pATCGAAGAGCTGAGGCG3’；
②23个碱基长的特异性寡脱氧核苷酸链：
BP23-6C：5’CGCCTCAGCTCTTCGATCCCCCC3’；
③30个碱基长且没有掺入脱氧次黄嘌呤的特异性寡脱氧核苷酸链：
SST30B6G：5’GTTCTAGAATCTTGATCACGCCTAGGGGGG3’；
④SST30B6G的第25位碱基G被脱氧次黄嘌呤I替代的寡脱氧核苷酸链：SST30B-5I5G：5’
GTTCTAGAATCTTGATCACGCCTAIGGGGG3’；
⑤SST30B6G第26位碱基G被脱氧次黄嘌呤I替代的寡脱氧核苷酸链：SST30B1G-4I4G：5’
GTTCTAGAATCTTGATCACGCCTAGIGGGG3’；
⑥SST30B6G第27位碱基G被脱氧次黄嘌呤I替代的寡脱氧核苷酸链：SST30B2G-3I3G：5’
GTTCTAGAATCTTGATCACGCCTAGGIGGG3’；
⑦SST30B6G第28位碱基G被脱氧次黄嘌呤I替代的寡脱氧核苷酸链：SST30B3G-2I2G：5’
GTTCTAGAATCTTGATCACGCCTAGGGIGG3’；
⑧SST30B6G第29位碱基G被脱氧次黄嘌呤I替代的寡脱氧核苷酸链：SST30B4G-1I1G：5’
GTTCTAGAATCTTGATCACGCCTAGGGGIG3’；
⑨SST30B6G第30位碱基G被脱氧次黄嘌呤I替代的寡脱氧核苷酸链：SST30B5G0I：5’
GTTCTAGAATCTTGATCACGCCTAGGGGGI3’；
单链5’Phos-TE17和单链BP23-6C经常规杂交反应后，能互补匹配形成双链杂合体(5’ Phos-TE17-BP23-6C)，此杂合体一边为平末端，另一边是一个6个C(polyC6)的粘末端(6个C 的单链)。
①5’Phos-TE17-BP23-6C与SST30B6G混合并加入Quick T4连接酶，5’Phos-TE17-BP23-6C 末端的6个C能与SST30B6G的3’末端的6个G互补匹配，从而，5’Phos-TE17-BP23-6C与 SST30B6G能被连接起来，如图2的D中2所示，在聚丙烯酰胺凝胶上形成40～50bps的清晰条 带，若不加入连接酶(图2的D中1所示)，在40～50bps位置没有相应条带；
②5’Phos-TE17-BP23-6C与SST30B-5I5G混合并加入Quick T4连接酶，5’ Phos-TE17-BP23-6C末端的6个C能与SST30B-5I5G的3’末端的5个G和1个I互补匹配，如 图2的D中3所示，在聚丙烯酰胺凝胶上也形成40～50bps的清晰条带，说明5’Phos-TE17-BP23-6C 与SST30B-5I5G能被连接起来，而且与阳性对照(SST30B6G，即没有脱氧次黄嘌呤I替代)相 比，连接产物浓度基本一致，由此说明在连接位点旁边5位(“-5”)有I:C配对不影响Quick T4 连接酶的连接作用；
③5’Phos-TE17-BP23-6C与SST30B1G-4I4G混合并加入Quick T4连接酶，5’ Phos-TE17-BP23-6C末端的6个C能与SST30B1G-4I4G的3’末端的4个G、1个I和1个G互 补匹配，如图2的D中4所示，在聚丙烯酰胺凝胶上也形成40～50bps的清晰条带，说明5’ Phos-TE17-BP23-6C与SST30B1G-4I4G能被连接起来，而且与阳性对照(SST30B6G，即没有脱 氧次黄嘌呤I替代)相比，连接产物浓度基本一致，由此说明在连接位点旁边4位(“-4”)有I:C 配对不影响Quick T4连接酶的连接作用；
④5’Phos-TE17-BP23-6C与SST30B2G-3I3G混合并加入Quick T4连接酶，5’ Phos-TE17-BP23-6C末端的6个C能与SST30B2G-3I3G的3’末端的3个G、1个I和2个G互 补匹配，如图2的D中5所示，在聚丙烯酰胺凝胶上也形成40～50bps的清晰条带，说明5’ Phos-TE17-BP23-6C与SST30B2G-3I3G能被连接起来，而且与阳性对照(SST30B6G，即没有脱 氧次黄嘌呤I替代)相比，连接产物浓度基本一致，由此说明在连接位点旁边3位(“-3”)有I:C 配对不影响Quick T4连接酶的连接作用；
⑤5’Phos-TE17-BP23-6C与SST30B3G-2I2G混合并加入Quick T4连接酶，5’ Phos-TE17-BP23-6C末端的6个C能与SST30B3G-2I2G的3’末端的2个G、1个I和3个G互 补匹配，如图2的D中6所示，在聚丙烯酰胺凝胶上也形成40～50bps的清晰条带，说明5’ Phos-TE17-BP23-6C与SST30B3G-2I2G能被连接起来，而且与阳性对照(SST30B6G，即没有脱 氧次黄嘌呤I替代)相比，连接产物浓度基本一致，由此说明在连接位点旁边2位(“-2”)有I:C 配对不影响Quick T4连接酶的连接作用；
⑥5’Phos-TE17-BP23-6C与SST30B4G-1I1G混合并加入Quick T4连接酶，5’ Phos-TE17-BP23-6C末端的6个C能与SST30B4G-1I1G的3’末端的1个G、1个I和4个G互 补匹配，如图2的D中7所示，在聚丙烯酰胺凝胶上也形成40～50bps的清晰条带，说明5’ Phos-TE17-BP23-6C与SST30B4G-1I1G能被连接起来，而且与阳性对照(SST30B6G，即没有脱 氧次黄嘌呤I替代)相比，连接产物浓度基本一致，由此说明在连接位点旁边1位(“-1”)有I:C 配对不影响Quick T4连接酶的连接作用；
⑦5’Phos-TE17-BP23-6C与SST30B5G0I混合并加入Quick T4连接酶，5’ Phos-TE17-BP23-6C末端的6个C与SST30B5G0I的3’末端的1个I和5个G互补，如图2的 D中8所示，在聚丙烯酰胺凝胶上形成了40～50bps大小的清晰条带，说明5’Phos-TE17-BP23-6C 与SST30B5G0I能被连接起来，由此说明在连接位点(“0”)有I:G配对的话会极大地影响Quick T4连接酶的连接作用；而且与阳性对照(SST30B6G，即没有脱氧次黄嘌呤I替代)相比，连接 产物浓度下降不多，由此说明在连接位点(“0”)有I:C配对Quick T4连接酶的连接作用影响不 大；
综上所述，可见，只有“0”位，即发生连接反应的位点有I:C配对会轻微地影响Quick T4 连接酶的连接作用，而其他位置(“-5”～“-1”)的I:C配对均没有影响。
进一步，本发明所述的三位点替代为：
鉴于在连接位点旁边第5、4或3位(“-5”、“-4”或“-3”位)掺入I均对I:G、I:A、I:T 和I:C配对完全不影响连接酶作用，而在连接位点旁边第2、1或0位(“-2”、“-1”或“0”位) 掺入I对I:G、I:A、I:T和I:C配对会产生不一样的连接反应影响，我们尝试在“-5”、“-4”和 “-3”位同时掺入3个I，考察3I:3G、3I:3A、3I:3T和3I:3C配对对连接酶作用的影响。
(a)脱氧次黄嘌呤I在脱氧寡核苷酸单链连接位点旁边的第3、第4和第5个碱基位替代胞 嘧啶C，与鸟嘌呤G配对
①17个碱基长的5’-末端磷酸化的特异性寡脱氧核苷酸链：
5’Phos-TE 17：5’pATCGAAGAGCTGAGGCG3’；
②23个碱基长的特异性寡脱氧核苷酸链：
BP23-6G：5’CGCCTCAGCTCTTCGATGGGGGG3’；
③30个碱基长且没有掺入脱氧次黄嘌呤的特异性寡脱氧核苷酸链：
SST30B6C：5’GTTCTAGAATCTTGATCACGCCTACCCCCC3’；
④SST30B6C的第25、26和27位碱基C均被脱氧次黄嘌呤I替代的寡脱氧核苷酸链：
SST30B3I3C：5’GTTCTAGAATCTTGATCACGCCTAIIICCC3’；
单链5’Phos-TE17和单链BP23-6G经常规杂交反应后，能互补匹配形成双链杂合体(5’ Phos-TE17-BP23-6G)，此杂合体一边为平末端，另一边是一个6个G(polyG6)的粘末端(6个 G的单链)。①5’Phos-TE17-BP23-6G与SST30B6C混合并加入Quick T4连接酶，5’ Phos-TE17-BP23-6G末端的6个G能与SST30B6C的3’末端的6个C互补匹配，从而，5’ Phos-TE17-BP23-6G与SST30B6C能被连接起来，如图3中1所示，在聚丙烯酰胺凝胶上形成40～ 50bps的清晰条带；②5’Phos-TE17-BP23-6G与SST30B3I3C混合并加入Quick T4连接酶，5’ Phos-TE17-BP23-6G末端的6个G与SST30B3I3C的3’末端的3个C+3个I配对，如图3中2 所示，聚丙烯酰胺凝胶上在40～50bps位置没有清晰条带，即没有连接产物产生，说明5’ Phos-TE17-BP23-6G与SST30B3I3C不能被连接起来，由此说明在连接位点旁边第5、4和3(“-5”、 “-4”和“-3”)碱基位同时有3个I:G配对完全抑制了Quick T4连接酶的连接作用。
(b)脱氧次黄嘌呤I在脱氧寡核苷酸单链连接位点旁边的第3、第4和第5个碱基位替代胸 腺嘧啶T，与腺嘌呤A配对
①17个碱基长的5’-末端磷酸化的特异性寡脱氧核苷酸链：
5’Phos-TE 17：5’pTTCGGAGAGCTGAGGCG3’；
②23个碱基长的特异性寡脱氧核苷酸链：
BP23-6A：5’CGCCTCAGCTCTTCGATAAAAAA3’；
③30个碱基长且没有掺入脱氧次黄嘌呤的特异性寡脱氧核苷酸链：
SST30B6T：5’GTTCTAGAATCTTGATCACGCCTATTTTTT3’；
④SST30B6T的第25、26和27位碱基T均被脱氧次黄嘌呤I替代的寡脱氧核苷酸链：
SST30B3I3T：5’GTTCTAGAATCTTGATCACGCCTAIIITTT3’；
单链5’Phos-TE17和单链BP23-6A经常规杂交反应后，能互补匹配形成双链杂合体(5’ Phos-TE17-BP23-6A)，此杂合体一边为平末端，另一边是一个6个A(polyA6)的粘末端(6个 A的单链)。①5’Phos-TE17-BP23-6A与SST30B6T混合并加入Quick T4连接酶，5’ Phos-TE17-BP23-6A末端的6个A能与SST30B6T的3’末端的6个T互补匹配，从而，5’ Phos-TE17-BP23-6A与SST30B6T能被连接起来，如图3泳道3所示，在聚丙烯酰胺凝胶上40～ 50bps位置处有清晰的目的条带；②5’Phos-TE17-BP23-6A与SST30B3I3T混合并加入Quick T4 连接酶，5’Phos-TE17-BP23-6A末端的6个A与SST30B3I3T的3’末端的3个T+3个I配对， 如图3泳道4所示，聚丙烯酰胺凝胶上在40～50bps位置没有清晰条带，即没有连接产物产生， 说明5’Phos-TE17-BP23-6A与SST30B3I3T不能被连接起来，由此说明在连接位点旁边第5、4 和3(“-5”、“-4”和“-3”)碱基位同时有3个I:A配对完全抑制了Quick T4连接酶的连接作 用。
(c)脱氧次黄嘌呤I在脱氧寡核苷酸单链连接位点旁边的第3、第4和第5个碱基位替代腺 嘌呤A，与胸腺嘧啶T配对
①17个碱基长的5’-末端磷酸化的特异性寡脱氧核苷酸链：
5’Phos-TE 17：5’pATCGAAGAGCTGAGGCG3’；
②23个碱基长的特异性寡脱氧核苷酸链：
BP23-6T：5’CGCCTCAGCTCTTCGATTTTTTT3’；
③30个碱基长且没有掺入脱氧次黄嘌呤的特异性寡脱氧核苷酸链：
SST30B6A：5’GTTCTAGAATCTTGATCACGCCTAAAAAAA3’；
④SST30B6A的第25、26和27位碱基A均被脱氧次黄嘌呤I替代的寡脱氧核苷酸链：
SST30B3I3A：5’GTTCTAGAATCTTGATCACGCCTAIIIAAA3’；
单链5’Phos-TE17和单链BP23-6T经常规杂交反应后，能互补匹配形成双链杂合体(5’ Phos-TE17-BP23-6T)，此杂合体一边为平末端，另一边是一个6个T(polyT6)的粘末端(6个 T的单链)。①5’Phos-TE17-BP23-6T与SST30B6A混合并加入Quick T4连接酶，5’ Phos-TE17-BP23-6T末端的6个T能与SST30B6A的3’末端的6个A互补匹配，从而，5’ Phos-TE17-BP23-6T与SST30B6A能被连接起来，如图3泳道5所示，聚丙烯酰胺凝胶上形成40～ 50bps大小的清晰目的条带；②5’Phos-TE17-BP23-6T与SST30B3I3A混合并加入Quick T4连接 酶，5’Phos-TE17-BP23-6T末端的6个T与SST30B3I3A的3’末端的3个A+3个I配对，如图 3泳道6所示，聚丙烯酰胺凝胶上在40～50bps位置没有清晰条带，即没有连接产物产生，说明5’ Phos-TE17-BP23-6A与SST30B3I3T不能被连接起来，由此说明在连接位点旁边第5、4和3(“-5”、 “-4”和“-3”)碱基位同时有3个I:T配对完全抑制了QuickT4连接酶的连接作用。
(d)脱氧次黄嘌呤I在脱氧寡核苷酸单链连接位点旁边的第3、第4和第5个碱基位替代鸟 嘌呤G，与胞嘧啶C配对
①17个碱基长的5’-末端磷酸化的特异性寡脱氧核苷酸链：
5’Phos-TE 17：5’pATCGAAGAGCTGAGGCG3’；
②23个碱基长的特异性寡脱氧核苷酸链：
BP23-6C：5’CGCCTCAGCTCTTCGATCCCCCC3’；
③30个碱基长且没有掺入脱氧次黄嘌呤的特异性寡脱氧核苷酸链：
SST30B6G：5’GTTCTAGAATCTTGATCACGCCTAGGGGGG3’；
④SST30B6G的第25、26和27位碱基G均被脱氧次黄嘌呤I替代的寡脱氧核苷酸链：
SST30B3I3G：5’GTTCTAGAATCTTGATCACGCCTAIIIGGG3’；
单链5’Phos-TE17和单链BP23-6C经常规杂交反应后，能互补匹配形成双链杂合体(5’ Phos-TE17-BP23-6C)，此杂合体一边为平末端，另一边是一个6个C(polyC6)的粘末端(6个 C的单链)。①5’Phos-TE17-BP23-6C与SST30B6G混合并加入Quick T4连接酶，5’ Phos-TE17-BP23-6C末端的6个C能与SST30B6G的3’末端的6个G互补匹配，从而，5’ Phos-TE17-BP23-6C与SST30B6G能被连接起来，如图3泳道7所示，聚丙烯酰胺凝胶上在40～ 50bps大小位置有清晰的目的条带；②5’Phos-TE17-BP23-6C与SST30B3I3G混合并加入Quick T4 连接酶，5’Phos-TE17-BP23-6C末端的6个C与SST30B3I3G的3’末端的3个G+3个I配对， 如图3泳道8所示，聚丙烯酰胺凝胶上在40～50bps位置有清晰目的条带，即有连接产物产生， 说明5’Phos-TE17-BP23-6C与SST30B3I3G能被连接起来；而且，产物浓度与对照(没有掺入I， 泳道7)基本一致，由此说明在连接位点旁边第5、4和3(“-5”、“-4”和“-3”)碱基位同时 有3个I:C配对完全不影响Quick T4连接酶的连接作用。
进一步，本发明所述双位点替代为：
鉴于在连接位点旁边第5、4或3位(“-5”、“-4”或“-3”位)掺入单个I形成I:G、I:A、 I:T和I:C配对后完全不影响连接酶作用，而同时掺入3个I形成3I:3G、3I:3A、3I:3T和3I:3C配 对会产生不一样的连接反应影响(3I:3G、3I:3A和3I:3T配对均完全抑制连接反应，而3I:3C配 对完全不影响连接反应)，我们尝试在“-5”、“-4”和“-3”位同时掺入2个I，来考察2I:2G、 2I:2A和2I:2T配对对连接酶作用的影响(不用考察2I:2C配对对连接酶作用的影响)。
1)脱氧次黄嘌呤I在脱氧寡核苷酸单链连接位点旁边的第3和第4位、第3和第5位，第4 和第5位碱基位替代胞嘧啶C，与鸟嘌呤G配对
①17个碱基长的5’-末端磷酸化的特异性寡脱氧核苷酸链：
5’Phos-TE 17：5’pATCGAAGAGCTGAGGCG3’；
②23个碱基长的特异性寡脱氧核苷酸链：
BP23-6G：5’CGCCTCAGCTCTTCGATGGGGGG3’；
③30个碱基长且没有掺入脱氧次黄嘌呤的特异性寡脱氧核苷酸链：
SST30B6C：5’GTTCTAGAATCTTGATCACGCCTACCCCCC3’；
④SST30B6C第26和27位碱基C被脱氧次黄嘌呤I替代的寡脱氧核苷酸链：
SST30B1C-4I-3I3C：5’GTTCTAGAATCTTGATCACGCCTACIICCC3’；
⑤SST30B6C第25和27位碱基C被脱氧次黄嘌呤I替代的寡脱氧核苷酸链：
SST30B-5I1C-3I3C：5’GTTCTAGAATCTTGATCACGCCTAICICCC3’；
⑥SST30B6C第25和26位碱基C被脱氧次黄嘌呤I替代的寡脱氧核苷酸链：SST30B-5I-4I4C：
5’GTTCTAGAATCTTGATCACGCCTAIICCCC3’；
单链5’Phos-TE17和单链BP23-6G经常规杂交反应后，能互补匹配形成双链杂合体(5’ Phos-TE17-BP23-6G)，此杂合体一边为平末端，另一边是一个6个G(polyG6)的粘末端(6个 G的单链)。
①5’Phos-TE17-BP23-6G与SST30B6C混合并加入Quick T4连接酶，5’Phos-TE17-BP23-6G 末端的6个G能与SST30B6C的3’末端的6个C互补匹配，从而，5’Phos-TE17-BP23-6G与 SST30B6C能被连接起来，如图4中的9所示，聚丙烯胺凝胶上在40～50bps位置处形成清晰的 目的条带；
②5’Phos-TE17-BP23-6G与SST30B1C-4I-3I3C混合并加入Quick T4连接酶，5’ Phos-TE17-BP23-6G末端的6个G与SST30B1C-4I-3I3C的3’末端的1个C和2个I(“-4”和 “-3”位)+3个C配对，如图4中10所示，聚丙烯酰胺凝胶上在40～50bps位置上基本没有目 的条带，说明在连接位点旁边第4和3位(“-4”和“-3”)同时有2个I:G配对会完全抑制Quick T4 连接酶的连接作用；
③5’Phos-TE17-BP23-6G与SST30B-5I1C-3I3C混合并加入Quick T4连接酶，5’ Phos-TE17-BP23-6G末端的6个G与SST30B-5I1C-3I3C的3’末端的1个I(“-5”位)、1个C 和1个I(“-3”位)+3个C配对，如图4中11所示，聚丙烯酰胺凝胶上在40～50bps位置处基 本没有目的条带，说明在连接位点旁边5和3位(“-5”和“-3”)同时有2个I:G配对会完全抑制 Quick T4连接酶的连接作用；
④5’Phos-TE17-BP23-6G与SST30B-5I-4I4C混合并加入Quick T4连接酶，5’ Phos-TE17-BP23-6G末端的6个G与SST30B-5I-4I4C的3’末端的2个I(“-5”和“-4”)和4个 C配对，如图4中12所示，聚丙烯酰胺凝胶上在40～50bps位置处有微弱的目的条带，与阳性对 照(SST30B6C，图4中9所示，即没有脱氧次黄嘌呤I替代)相比，连接产物浓度下降明显，由 此说明在连接位点旁边5和4位(“-5”和“-4”位)有2个I:G配对会对Quick T4连接酶的连接作 用有较大影响。
2)脱氧次黄嘌呤I在脱氧寡核苷酸单链连接位点旁边的第3和第4位、第3和第5位，第4 和第5位碱基位替代胸腺嘧啶T，与腺嘌呤A配对
①17个碱基长的5’-末端磷酸化的特异性寡脱氧核苷酸链：
5’Phos-TE 17：5’pATCGAAGAGCTGAGGCG3’；
②23个碱基长的特异性寡脱氧核苷酸链：
BP23-6A：5’CGCCTCAGCTCTTCGATAAAAAA3’；
③30个碱基长且没有掺入脱氧次黄嘌呤的特异性寡脱氧核苷酸链：
SST30B6T：5’GTTCTAGAATCTTGATCACGCCTATTTTTT3’；
④SST30B6T第26和27位碱基T被脱氧次黄嘌呤I替代的寡脱氧核苷酸链：
SST30B1T-4I-3I3T：5’GTTCTAGAATCTTGATCACGCCTATIITTT3’；
⑤SST30B6T第25和27位碱基T被脱氧次黄嘌呤I替代的寡脱氧核苷酸链：
SST30B-5I1T-3I3T：5’GTTCTAGAATCTTGATCACGCCTAITITTT3’；
⑥SST30B6T第25和26位碱基T被脱氧次黄嘌呤I替代的寡脱氧核苷酸链：SST30B-5I-4I4T：
5’GTTCTAGAATCTTGATCACGCCTAIITTTT3’；
单链5’Phos-TE17和单链BP23-6A经常规杂交反应后，能互补匹配形成双链杂合体(5’ Phos-TE17-BP23-6A)，此杂合体一边为平末端，另一边是一个6个A(polyA6)的粘末端(6个 A的单链)。
①5’Phos-TE17-BP23-6A与SST30B6T混合并加入Quick T4连接酶，5’Phos-TE17-BP23-6A 末端的6个A能与SST30B6T的3’末端的6个T互补匹配，从而，5’Phos-TE17-BP23-6A与 SST30B6T能被连接起来，如图4泳道1所示，聚丙烯酰胺凝胶上在40～50bps位置处形成清晰 的目的条带；
②5’Phos-TE17-BP23-6A与SST30B1T-4I-3I3T混合并加入Quick T4连接酶，5’ Phos-TE17-BP23-6A末端的6个A与SST30B1T-4I-3I3T的3’末端的1个T+2个I(“-4”和“-3” 位)+3个T配对，如图4中2所示，聚丙烯酰胺凝胶上在40～50bps位置上有目的条带，但与阳 性对照(SST30B6T，图4中1所示，即没有脱氧次黄嘌呤I替代)相比，连接产物浓度较低，说 明在连接位点旁边4和3位(“-4”和“-3”)同时有2个I:A配对会极大地影响Quick T4连接酶的 连接作用；
③5’Phos-TE17-BP23-6A与SST30B-5I1T-3I3T混合并加入Quick T4连接酶，5’ Phos-TE17-BP23-6A末端的6个A与SST30B-5I1T-3I3T的3’末端的1个I(“-5”位)+1个T+1 个I(“-3”位)+3个T配对，如图4中3所示，聚丙烯酰胺凝胶上在40～50bps位置处有目的 条带，但与阳性对照(SST30B6T，图4中1所示，即没有脱氧次黄嘌呤I替代)相比，连接产物 浓度较低，说明在连接位点旁边第5和3位(“-5”和“-3”)同时有2个I:A配对会极大地影响 Quick T4连接酶的连接作用；
④5’Phos-TE17-BP23-6A与SST30B-5I-4I4T混合并加入Quick T4连接酶，5’ Phos-TE17-BP23-6A末端的6个A与SST30B-5I-4I4T的3’末端的2个I(“-5”和“-4”)+4个T 配对，如图4中4所示，聚丙烯酰胺凝胶上在40～50bps位置处有清晰的目的条带，说明5’ Phos-TE17-BP23-6A与SST30B-5I-4I4T能被连接起来，与阳性对照(SST30B6T，图4中1所示， 即没有脱氧次黄嘌呤I替代)相比，连接产物浓度有所下降，由此说明在连接位点旁边5和4位(“-5” 和“-4”位)有2个I:A配对会部分影响Quick T4连接酶的连接作用。
3)脱氧次黄嘌呤I在脱氧寡核苷酸单链连接位点旁边的第3和第4位、第3和第5位，第4 和第5位碱基位替代腺嘌呤A，与胸腺嘧啶T配对
①17个碱基长的5’-末端磷酸化的特异性寡脱氧核苷酸链：
5’Phos-TE 17：5’pATCGAAGAGCTGAGGCG3’；
②23个碱基长的特异性寡脱氧核苷酸链：
BP23-6T：5’CGCCTCAGCTCTTCGATTTTTTT3’；
③30个碱基长且没有掺入脱氧次黄嘌呤的特异性寡脱氧核苷酸链：
SST30B6A：5’GTTCTAGAATCTTGATCACGCCTAAAAAAA3’；
④SST30B6A第26和27位碱基A被脱氧次黄嘌呤I替代的寡脱氧核苷酸链：
SST30B1A-4I-3I3A：5’GTTCTAGAATCTTGATCACGCCTAAIIAAA3’；
⑤SST30B6A第25和27位碱基A被脱氧次黄嘌呤I替代的寡脱氧核苷酸链：
SST30B-5I1A-3I3A：5’GTTCTAGAATCTTGATCACGCCTAIAIAAA3’；
⑥SST30B6A第25和26位碱基A被脱氧次黄嘌呤I替代的寡脱氧核苷酸链：
SST30B-5I-4I4A：5’GTTCTAGAATCTTGATCACGCCTAIIAAAA3’；
单链5’Phos-TE17和单链BP23-6T经常规杂交反应后，能互补匹配形成双链杂合体(5’ Phos-TE17-BP23-6T)，此杂合体一边为平末端，另一边是一个6个T(polyT6)的粘末端(6个 T的单链)。
①5’Phos-TE17-BP23-6T与SST30B6A混合并加入Quick T4连接酶，5’Phos-TE17-BP23-6T 末端的6个T能与SST30B6A的3’末端的6个A互补匹配，从而，5’Phos-TE17-BP23-6T与 SST30B6A能被连接起来，如图4中5所示，聚丙烯酰胺凝胶上在40～50bps位置处形成清晰的 目的条带；
②5’Phos-TE17-BP23-6T与SST30B1A-4I-3I3A混合并加入Quick T4连接酶，5’ Phos-TE17-BP23-6T末端的6个T与SST30B1A-4I-3I3A的3’末端的1个A+2个I(“-4”和“-3” 位)+3个A配对，如图4中6所示，聚丙烯酰胺凝胶上在40～50bps位置上基本没有目的条带， 说明在连接位点旁边第4和3位(“-4”和“-3”)同时有2个I:T配对会基本上完全抑制Quick T4 连接酶的连接作用；
③5’Phos-TE17-BP23-6T与SST30B-5I1A-3I3A混合并加入Quick T4连接酶，5’ Phos-TE17-BP23-6T末端的6个T与SST30B-5I1A-3I3A的3’末端的1个I(“-5”位)+1个A+1 个I(“-3”位)+3个A配对，如图4中7所示，聚丙烯酰胺凝胶上在40～50bps位置处有一微 弱的目的条带，与阳性对照(SST30B6A，图4中5所示，即没有脱氧次黄嘌呤I替代)相比，连 接产物浓度极低，说明在连接位点旁边第5和3位(“-5”和“-3”)同时有2个I:T配对会极大地 影响Quick T4连接酶的连接作用；
④5’Phos-TE17-BP23-6T与SST30B-5I-4I4A混合并加入Quick T4连接酶，5’ Phos-TE17-BP23-6T末端的6个T与SST30B-5I-4I4A的3’末端的2个I(“-5”和“-4”)+4个A 配对，如图4中8所示，聚丙烯酰胺凝胶上在40～50bps位置处有清晰的目的条带，说明5’ Phos-TE17-BP23-6T与SST30B-5I-4I4A能被连接起来，与阳性对照(SST30B6A，图4中5所示， 即没有脱氧次黄嘌呤I替代)相比，连接产物浓度有所下降，由此说明在连接位点旁边第5和4 位(“-5”和“-4”位)有2个I:T配对会部分影响Quick T4连接酶的连接作用。
另一方面，本发明所述脱氧次黄嘌呤I的掺入提高寡脱氧核苷酸链的有效连接长度
①17个碱基长的5’-末端磷酸化的特异性寡脱氧核苷酸链：
5’Phos-TE 17：5’pATCGAAGAGCTGAGGCG3’；
②23个碱基长的特异性寡脱氧核苷酸链：
BP23-6T：5’CGCCTCAGCTCTTCGATTTTTTT3’；
③BP23-6T减少3’末端2个碱基T的特异性寡脱氧核苷酸链(21个碱基长)：
BP21-4T：5’CGCCTCAGCTCTTCGATTTTT3’；
④BP23-6T第18和19位碱基T被脱氧次黄嘌呤I替代的寡脱氧核苷酸链(即BP21-4T在第 18和19位掺入2个脱氧次黄嘌呤I)：
BP23-5I-4I4T：5’CGCCTCAGCTCTTCGATIITTTT3’
⑤30个碱基长且没有掺入脱氧次黄嘌呤的特异性寡脱氧核苷酸链：
SST30B6A：5’GTTCTAGAATCTTGATCACGCCTAAAAAAA3’；
单链5’Phos-TE17和单链BP23-6T经常规杂交反应后，能互补匹配形成双链杂合体(5’ Phos-TE17-BP23-6T)，此杂合体一边为平末端，另一边是一个6个T(polyT6)的粘末端(6个 T的单链)。5’Phos-TE17-BP23-6T与SST30B6A混合并加入Quick T4连接酶，5’ Phos-TE17-BP23-6T末端的6个T能与SST30B6A的3’末端的6个A互补匹配，从而，5’ Phos-TE17-BP23-6T与SST30B6A能被连接起来，如图5中2所示，聚丙烯酰胺凝胶上在40～50bps 位置处形成清晰的目的条带；而没有加入连接酶的阴性对照(图5中1所示)没有目的条带。
而单链5’Phos-TE17和单链BP21-4T经常规杂交反应后，也能互补匹配形成双链杂合体(5’ Phos-TE17-BP21-4T)，此杂合体一边也为平末端，另一边却是一个4个T(polyT4)的粘末端(4 个T的单链)，而不是6个T(polyT6)的粘末端(图5中2所示)。5’Phos-TE17-BP21-4T与 SST30B6A混合并加入Quick T4连接酶，5’Phos-TE17-BP21-4T末端只有4个T能与SST30B6A 的3’末端的4个A互补匹配，5’Phos-TE17-BP21-4T与SST30B6A也能被连接起来，如图5中 3所示，聚丙烯酰胺凝胶上在40～50bps位置处形成清晰的目的条带；但是，与对照(图5中2 所示)相比，由于减少了2个有效碱基匹配(2个T:A匹配)，导致热稳定性降低，从而连接产 物(目的条带)浓度有比较明显的下降。
当在单链BP21-4T第18和19位掺入2个脱氧次黄嘌呤I，或者说单链BP23-6T的第18和 19位碱基T被2个脱氧次黄嘌呤I替代，变成BP23-5I-4I4T。单链5’Phos-TE17和单链BP23-5I-4I4T 经常规杂交反应后，也能互补匹配形成双链杂合体(5’Phos-TE17-BP23-5I-4I4T)，此杂合体一 边也为平末端，另一边却是一个2个I和4个T的粘末端，再与SST30B6A混合并加入Quick T4 连接酶，5’Phos-TE17-BP23-5I-4I4T末端2个I和4个T能与SST30B6A的3’末端的6个A互 补匹配(包含“-5”和“-4”位的I:A配对)，5’Phos-TE17-BP23-5I-4I4T与SST30B6A也能被 连接起来，如图5中4所示，聚丙烯酰胺凝胶上在40～50bps位置处形成清晰的目的条带；而且 与阳性对照(没有掺入I，图5中2所示)相比，连接产物(目的条带)浓度基本不变，说明在 连接位点旁边5和4位(“-5”和“-4”)同时有2个I:T配对后对Quick T4连接酶的连接作用影响 不大；而与另一对照(只有4个T:A配对，图5中3所示)相比，连接产物浓度有明显增强，说 明脱氧次黄嘌呤I的掺入可以提高寡核苷酸的有效连接长度，从而提高配对寡核苷酸链的热稳定 性，由此提高连接效率。
与现有技术相比，本发明的有益效果主要体现在：本发明提供了一种脱氧次黄嘌呤作为通用 碱基在寡脱氧核苷酸链连接反应中应用的方法，本发明通过在寡脱氧核苷酸单链上进行单位点或 多位点替代脱氧次黄嘌呤，从而提高寡脱氧核苷酸单链有效连接长度或降低寡脱氧核苷酸链文库 大小，本发明所述的脱氧次黄嘌呤作为通用碱基相比于硝基吡咯等其他通用碱基，较易被公司合 成，故具有经济、方便等优点。
(四)附图说明
图1寡脱氧核苷酸链设计和连接反应示意图，其中5’Phos-TE17为17个碱基长的5’-末端磷 酸化的特异性寡脱氧核苷酸单链；BP23为23个碱基长的寡脱氧核苷酸单链，17个碱基长的黄色 区域与5’Phos-TE17互补匹配，6个碱基长的绿色区按要求进行脱氧次黄嘌呤的替代，根据离开 连接位点的距离不同，替代位置分别标记为0、-1、-2、-3、-4和-5；SST30B为30个碱基长的寡 脱氧核苷酸单链，6个碱基长的绿色区与BP23单链的绿色区互补匹配；
图2脱氧次黄嘌呤I单位点替代对QuickT4连接酶作用的影响，其中(A)为I对C的替代， (B)为I对T的替代，(C)为I对A的替代，(D)为I对G的替代，(A)～(D)中1～8为 泳道，0～-5为替代位点，M为标准分子量泳道，a为目的条带；
图3脱氧次黄嘌呤I三位点替代对Quick T4连接酶作用的影响，其中“+”表示有脱氧次黄 嘌呤I替代；“-”表示没有脱氧次黄嘌呤I替代，1～8为泳道，M为标准分子量泳道，a为目的 条带；
图4双位点脱氧次黄嘌呤I替代对Quick T4连接酶作用的影响，其中“+”表示有脱氧次黄 嘌呤I替代，“-”表示没有脱氧次黄嘌呤I替代；1～12为泳道，其中泳道1～4为I对T的替代， 泳道5～8为I对A的替代，泳道9～12为I对C的替代；M为标准分子量泳道，-3～-5为替代 位置，a为目的条带；
图5脱氧次黄嘌呤I掺入提高寡脱氧核苷酸链的有效连接长度，1～4为泳道，M为标准分子 量泳道，a为目的条带；
图6连接时间对脱氧次黄嘌呤I在-3位替代碱基T对连接反应的影响，1～5为泳道，M为标 准分子量泳道，a为目的条带，0～900为连接时间(min)；
图7连接酶量对脱氧次黄嘌呤I在-3位替代碱基T对连接反应的影响，1～5为泳道，M为标 准分子量泳道，a为目的条带，0、0.5、1、2和5分别表示连接酶量(U)；
图8连接温度对脱氧次黄嘌呤I在-3位替代碱基T对连接反应的影响，1～5为泳道，M为标 准分子量泳道，a为目的条带，10～30为连接温度(℃)；
(五)具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：
所述单链均为Integrated DNA Technologies公司合成。
实施例1寡核苷酸链上脱氧次黄嘌呤I单位点替代而产生的I:G、I:A、I:T和I:C配对的Quick T4 连接酶作用下的连接反应
5’Phos-TE17：5’pATCGAAGAGCTGAGGCG3’；
BP23-6G：5’CGCCTCAGCTCTTCGATGGGGGG3’；
SST30B6C：5’GTTCTAGAATCTTGATCACGCCTACCCCCC3’；
SST30B-5I5C：5’GTTCTAGAATCTTGATCACGCCTAICCCCC3’；
SST30B1C-4I4C：5’GTTCTAGAATCTTGATCACGCCTACICCCC3’；
SST30B2C-3I3C：5’GTTCTAGAATCTTGATCACGCCTACCICCC3’；
SST30B3C-2I2C：5’GTTCTAGAATCTTGATCACGCCTACCCICC3’；
SST30B4C-1I1C：5’GTTCTAGAATCTTGATCACGCCTACCCCIC3’；
SST30B5C0I：5’GTTCTAGAATCTTGATCACGCCTACCCCCI3’；
BP23-6A：5’CGCCTCAGCTCTTCGATAAAAAA3’；
SST30B6T：5’GTTCTAGAATCTTGATCACGCCTATTTTTT3’；
SST30B-5I5T：5’GTTCTAGAATCTTGATCACGCCTAITTTTT3’；
SST30B1T-4I4T：5’GTTCTAGAATCTTGATCACGCCTATITTTT3’；
SST30B2T-3I3T：5’GTTCTAGAATCTTGATCACGCCTATTITTT3’；
SST30B3T-2I2T：5’GTTCTAGAATCTTGATCACGCCTATTTITT3’；
SST30B4T-1I1T：5’GTTCTAGAATCTTGATCACGCCTATTTTIT3’；
SST30B5T0I：5’GTTCTAGAATCTTGATCACGCCTATTTTTI3’；
BP23-6T：5’CGCCTCAGCTCTTCGATTTTTTT3’；
SST30B6A：5’GTTCTAGAATCTTGATCACGCCTAAAAAAA3’；
SST30B-5I5A：5’GTTCTAGAATCTTGATCACGCCTAIAAAAA3’；
SST30B1A-4I4A：5’GTTCTAGAATCTTGATCACGCCTAAIAAAA3’；
SST30B2A-3I3A：5’GTTCTAGAATCTTGATCACGCCTAAAIAAA3’；
SST30B3A-2I2A：5’GTTCTAGAATCTTGATCACGCCTAAAAIAA3’；
SST30B4A-1I1A：5’GTTCTAGAATCTTGATCACGCCTAAAAAIA3’；
SST30B5A0I：5’GTTCTAGAATCTTGATCACGCCTAAAAAAI3’；
BP23-6C：5’CGCCTCAGCTCTTCGATCCCCCC3’；
SST30B6G：5’GTTCTAGAATCTTGATCACGCCTAGGGGGG3’；
SST30B-5I5G：5’GTTCTAGAATCTTGATCACGCCTAIGGGGG3’；
SST30B1G-4I4G：5’GTTCTAGAATCTTGATCACGCCTAGIGGGG3’；
SST30B2G-3I3G：5’GTTCTAGAATCTTGATCACGCCTAGGIGGG3’；
SST30B3G-2I2G：5’GTTCTAGAATCTTGATCACGCCTAGGGIGG3’；
SST30B4G-1I1G：5’GTTCTAGAATCTTGATCACGCCTAGGGGIG3’；
SST30B5G0I：5’GTTCTAGAATCTTGATCACGCCTAGGGGGI3’；
然后用pH8.0的TE缓冲液(10mM三羟甲基胺基甲烷-盐酸Tris-HCl，1mM乙二胺四乙酸 EDTA)将以上寡核苷酸链均配制成浓度为10μM的溶液(用紫外分光光度计定浓度)，再配制以 下32个反应组：
反应组1：1μl浓度为10μM的5’Phos-TE17加上1μl浓度为10μM的BP23-6G，再加上1μl 浓度为10μM的SST30B6C以及7μl的TE缓冲液(pH8.0)；
反应组2：同反应组1；
反应组3：反应组1中SST30B6C用SST30B-5I5C替代；
反应组4：反应组1中SST30B6C用SST30B1C-4I4C替代；
反应组5：反应组1中SST30B6C用SST30B2C-3I3C替代；
反应组6：反应组1中SST30B6C用SST30B3C-2I2C替代；
反应组7：反应组1中SST30B6C用SST30B4C-1I1C替代；
反应组8：反应组1中SST30B6C用SST30B5C0I替代；
反应组9：1μl浓度为10μM的5’Phos-TE17加上1μl浓度为10μM的BP23-6A，再加上1μl 浓度为10μM的SST30B6T以及7μl的TE缓冲液(pH8.0)；
反应组10：同反应组9；
反应组11：反应组9中SST30B6T用SST30B-5I5T替代；
反应组12：反应组9中SST30B6T用SST30B1T-4I4T替代；
反应组13：反应组9中SST30B6T用SST30B2T-3I3T替代；
反应组14：反应组9中SST30B6T用SST30B3T-2I2T替代；
反应组15：反应组9中SST30B6T用SST30B4T-1I1T替代；
反应组16：反应组9中SST30B6T用SST30B5T0I替代；
反应组17：1μl浓度为10μM的5’Phos-TE17加上1μl浓度为10μM的BP23-6T，再加上1μl 浓度为10μM的SST30B6A以及7μl的TE缓冲液(pH8.0)；
反应组18：同反应组17；
反应组19：反应组17中SST30B6A用SST30B-5I5A替代；
反应组20：反应组17中SST30B6A用SST30B1A-4I4A替代；
反应组21：反应组17中SST30B6A用SST30B2A-3I3A替代；
反应组22：反应组17中SST30B6A用SST30B3A-2I2A替代；
反应组23：反应组17中SST30B6A用SST30B4A-1I1A替代；
反应组24：反应组17中SST30B6A用SST30B5A0I替代；
反应组25：1μl浓度为10μM的5’Phos-TE17加上1μl浓度为10μM的BP23-6C，再加上1μl 浓度为10μM的SST30B6G以及7μl的TE缓冲液(pH8.0)；
反应组26：同反应组25；
反应组27：反应组25中SST30B6G用SST30B-5I5G替代；
反应组28：反应组25中SST30B6G用SST30B1G-4I4G替代；
反应组29：反应组25中SST30B6G用SST30B2G-3I3G替代；
反应组30：反应组25中SST30B6G用SST30B3G-2I2G替代；
反应组31：反应组25中SST30B6G用SST30B4G-1I1G替代；
反应组32：反应组25中SST30B6G用SST30B5G0I替代；
(1)连接反应：将32个反应组在95℃下处理5min后，以1℃/min的速率降温到10℃，然 后各加入10μl的连接液(66mM的三羟甲基胺基甲烷-盐酸(pH7.6)、10mM的氯化镁、1mM 的二硫苏糖醇、7.5％的PEG 6000、1mM ATP和2U的Quick T4连接酶)，反应组2、10、18 和26中不加入Quick T4连接酶作为阴性对照；然后将32组均在25℃下连接30min，紧接着在 65℃处理15min终止连接反应。(2)电泳检测：然后用10％的聚丙烯酰胺凝胶(10mL的10％聚 丙烯酰胺凝胶含有3.3mL的30％丙烯酰胺溶液，6μl的TEMED，100μl的10％过硫酸铵溶液，1mL 的5×TBE溶液和5.6mL的水，其中5×TBE溶液配方为：三羟甲基胺基甲烷，27.5g/L的硼酸， 10mM的乙二胺四乙酸二钠，用盐酸调pH至8.0)，在200毫伏电压下电泳45min，电泳结束后， 在0.5×TBE溶液中将聚丙烯酰胺凝胶用SYBR Green I核酸染料染色20min后，观察连接结果。
如图2所示：A中I:G配对时，当脱氧次黄嘌呤I替代位置在连接位置旁边第5、4、3、2或 1(“-5”、“-4”、“-3”、“-2”或“-1”，也就是反应组3、4、5、6、7，即图2的A中3、 4、5、6、7所示泳道)碱基位时，对连接反应基本没有影响，目的产物浓度与没有脱氧次黄嘌呤 I替代的反应(反应组1，即图2的A中2所示泳道在聚丙烯凝胶上形成40～50bps的清晰条带， M代表的泳道为标准分子量条带)基本一致，当替代位置在连接位置时(“0”，也就是反应组8， 即图2的A中8所示泳道)，对连接反应产生了极大影响，目的条带浓度极低。阴性对照没有连 接产物(反应组2，即图2的A中1所示泳道在40～50bps没有相应条带)；B中I:A配对时，当 脱氧次黄嘌呤I替代位置在连接位置旁边第5、4或3(“-5”、“-4”或“-3”，也就是反应组 11、12、13，即图2的B中3、4、5所示泳道)碱基位时，对连接反应基本没有影响，目的产物 浓度与没有脱氧次黄嘌呤I替代的反应(反应组9，即图2的B中2所示泳道)基本一致。随着 替代位置进一步向连接位置靠近，即连接位置旁边第2、1或0位(“-2”、“-1”或“0”，也 就是反应组14、15、16，即图2的B中6、7、8所示泳道)，对连接反应影响越来越大，当替代 位置在连接位置时(“0”，即图2的B中8所示泳道)，基本没有连接产物。阴性对照也没有连接 产物(反应组10，即图2的B中1所示泳道)；C中I:T配对时，当脱氧次黄嘌呤I替代位置在 连接位置旁边第5、4或3(“-5”、“-4”或“-3”，也就是反应组19、20、21，即图2的C中 3、4、5所示泳道)碱基位时，对连接反应基本没有影响，目的产物浓度与没有脱氧次黄嘌呤I 替代的反应(反应组17，即图2的C中2所示泳道)基本一致。随着替代位置进一步向连接位置 靠近，即连接位置旁边第2、1或0位(“-2”、“-1”或“0”，也就是反应组22、23、24，即 图2的C中6、7、8所示泳道)，对连接反应影响越来越大，当替代位置在连接位置时(“0”， 也就是反应组24，即图2的C中8所示泳道)，连接产物浓度变得非常低。阴性对照也没有连接 产物(反应组18，即图2的C中1所示泳道)；D中I:C配对时，当脱氧次黄嘌呤I替代位置在 连接位置旁边第5、4、3、2或1(“-5”、“-4”、“-3”、“-2”或“-1”，也就是反应组27、 28、29、30、31，即图2的D中3、4、5、6、7所示泳道)碱基位时，对连接反应基本没有影响， 目的产物浓度与没有脱氧次黄嘌呤I替代的反应(反应组25，即图2的D中2所示泳道)基本一 致，当替代位置在连接位置时(“0”，也就是反应组32，即图2的D中8所示泳道)，连接产 物浓度也较理想，影响不大，而阴性对照没有连接产物(反应组26，即图2的D中1所示泳道)。
综上可见，当脱氧次黄嘌呤I替代位置在连接位置旁边第3位碱基远以上，对各种配对(I:G、 I:A、I:T和I:C)下的Quick T4连接酶作用均没有影响，如果替代位置进一步靠近连接位点，对 不同的配对下的Quick T4连接酶作用不一样的影响，而且，替代位置越靠近连接位置，影响越大， 尤其是当替代位置就在连接位置上时，对I:G、I:A和I:T配对下的Quick T4连接酶作用均产生极 大影响。
实施例2寡核苷酸链上脱氧次黄嘌呤I三位点替代而产生的I:G、I:A、I:T和I:C配对的Quick T4 连接酶作用下的连接反应
5’Phos-TE17：5’pATCGAAGAGCTGAGGCG3’；
BP23-6G：5’CGCCTCAGCTCTTCGATGGGGGG3’；
SST30B6C：5’GTTCTAGAATCTTGATCACGCCTACCCCCC3’；
SST30B3I3C：5’GTTCTAGAATCTTGATCACGCCTAIIICCC3’；
BP23-6A：5’CGCCTCAGCTCTTCGATAAAAAA3’；
SST30B6T：5’GTTCTAGAATCTTGATCACGCCTATTTTTT3’；
SST30B3I3T：5’GTTCTAGAATCTTGATCACGCCTAIIITTT3’；
BP23-6T：5’CGCCTCAGCTCTTCGATTTTTTT3’；
SST30B6A：5’GTTCTAGAATCTTGATCACGCCTAAAAAAA3’；
SST30B3I3A：5’GTTCTAGAATCTTGATCACGCCTAIIIAAA3’；
BP23-6C：5’CGCCTCAGCTCTTCGATCCCCCC3’；
SST30B6G：5’GTTCTAGAATCTTGATCACGCCTAGGGGGG3’；
SST30B3I3G：5’GTTCTAGAATCTTGATCACGCCTAIIIGGG3’；
用pH8.0的TE缓冲液(10mM三羟甲基胺基甲烷-盐酸Tris-HCl，1mM乙二胺四乙酸EDTA) 将以上寡核苷酸链均配制成浓度为10μM的溶液(用紫外分光光度计定浓度)，再配制以下8个 反应组：
反应组1：1μl浓度为10μM的5’Phos-TE17加上1μl浓度为10μM的BP23-6G，再加上1μl 浓度为10μM的SST30B6C以及7μl的TE缓冲液(pH8.0)；
反应组2：反应组1中SST30B6C用SST30B3I3C替代；
反应组3：1μl浓度为10μM的5’Phos-TE17加上1μl浓度为10μM的BP23-6A，再加上1μl 浓度为10μM的SST30B6T以及7μl的TE缓冲液(pH8.0)；
反应组4：反应组3中SST30B6T用SST30B3I3T替代；
反应组5：1μl浓度为10μM的5’Phos-TE17加上1μl浓度为10μM的BP23-6T，再加上1μl 浓度为10μM的SST30B6A以及7μl的TE缓冲液(pH8.0)；
反应组6：反应组5中SST30B6A用SST30B3I3A替代；
反应组7：1μl浓度为10μM的5’Phos-TE17加上1μl浓度为10μM的BP23-6C，再加上1μl 浓度为10μM的SST30B6G以及7μl的TE缓冲液(pH8.0)；
反应组8：反应组7中SST30B6G用SST30B3I3G替代；
上述8个反应组的连接反应和电泳检测同实施例1，结果见图3。
如图3所示：当脱氧次黄嘌呤I在连接位置旁边第5、4和3(“-5”、“-4”和“-3”，即 图3中2所示泳道)碱基位有3个替代而产生3个I:G配对时(反应组2)，基本没有连接产物， 而没有脱氧次黄嘌呤I替代时(“-5”、“-4”和“-3”均为C:G配对，也就是反应组1，即图3 中1所示泳道)有清晰的目的产物；当脱氧次黄嘌呤I在连接位置旁边第5、4和3(“-5”、“-4” 和“-3”，即图3中4所示泳道)碱基位有3个替代而产生3个I:A配对时(反应组4)也基本没 有连接产物，而没有脱氧次黄嘌呤I替代时(“-5”、“-4”和“-3”均为T:A配对，即反应组3， 图3中3所示泳道)有清晰的目的产物；当脱氧次黄嘌呤I在连接位置旁边第5、4和3(“-5”、 “-4”和“-3”，即图3中6所示泳道)碱基位有3个替代而产生3个I:T配对时(反应组6)也 基本没有连接产物，而没有脱氧次黄嘌呤I替代时(“-5”、“-4”和“-3”均为A:T配对，即反 应组5，图3中5所示泳道)有清晰的目的产物；当脱氧次黄嘌呤I在连接位置旁边第5、4和3 (“-5”、“-4”和“-3”，即图3中8所示泳道)碱基位有3个替代而产生3个I:C配对时(反 应组8)有清晰的连接产物，而且与对照即没有脱氧次黄嘌呤I替代时(“-5”、“-4”和“-3” 均为G:C配对，即反应组7，图3中7所示泳道)相比，连接产物浓度基本一致。
综上可见，当脱氧次黄嘌呤I在连接位置旁边第5、4和3碱基位同时有3个替代时，对I:G、 I:A和I:T配对下的Quick T4连接酶作用均有极大的影响，而对I:C配对下的连接反应没有影响。 实施例3寡核苷酸链上脱氧次黄嘌呤I双位点替代而产生的I:G、I:A、和I:T配对的Quick T4连
接酶作用下的连接反应
5’Phos-TE17：5’pATCGAAGAGCTGAGGCG3’；
BP23-6A：5’CGCCTCAGCTCTTCGATAAAAAA3’；
SST30B6T：5’GTTCTAGAATCTTGATCACGCCTATTTTTT3’；
SST30B1T-4I-3I3T：5’GTTCTAGAATCTTGATCACGCCTATIITTT3’；
SST30B-5I1T-3I3T：5’GTTCTAGAATCTTGATCACGCCTAITITTT3’；
SST30B-5I-4I4T：5’GTTCTAGAATCTTGATCACGCCTAIITTTT3’；
BP23-6T：5’CGCCTCAGCTCTTCGATTTTTTT3’；
SST30B6A：5’GTTCTAGAATCTTGATCACGCCTAAAAAAA3’；
SST30B1A-4I-3I3A：5’GTTCTAGAATCTTGATCACGCCTAAIIAAA3’；
SST30B-5I1A-3I3A：5’GTTCTAGAATCTTGATCACGCCTAIAIAAA3’；
SST30B-5I-4I4A：5’GTTCTAGAATCTTGATCACGCCTAIIAAAA3’；
BP23-6G：5’CGCCTCAGCTCTTCGATGGGGGG3’；
SST30B6C：5’GTTCTAGAATCTTGATCACGCCTACCCCCC3’；
SST30B1C-4I-3I3C：5’GTTCTAGAATCTTGATCACGCCTACIICCC3’；
SST30B-5I1C-3I3C：5’GTTCTAGAATCTTGATCACGCCTAICICCC3’；
SST30B-5I-4I4C：5’GTTCTAGAATCTTGATCACGCCTAIICCCC3’；
用pH8.0的TE缓冲液(10mM三羟甲基胺基甲烷-盐酸Tris-HCl，1mM乙二胺四乙酸EDTA) 将以上寡核苷酸链均配制成浓度为10μM的溶液(用紫外分光光度计定浓度)，再配制以下12个 反应组：
反应组1：1μl浓度为10μM的5’Phos-TE17加上1μl浓度为10μM的BP23-6A，再加上1μl 浓度为10μM的SST30B6T以及7μl的TE缓冲液(pH8.0)；
反应组2：反应组1中SST30B6T用SST30B1T-4I-3I3T替代；
反应组3：反应组1中SST30B6T用SST30B-5I1T-3I3T替代；
反应组4：反应组1中SST30B6T用SST30B-5I-4I4T替代；
反应组5：1μl浓度为10μM的5’Phos-TE17加上1μl浓度为10μM的BP23-6T，再加上1μl 浓度为10μM的SST30B6A以及7μl的TE缓冲液(pH8.0)；
反应组6：反应组5中SST30B6A用SST30B1A-4I-3I3A替代；
反应组7：反应组5中SST30B6A用SST30B-5I1A-3I3A替代；
反应组8：反应组5中SST30B6A用SST30B-5I-4I4A替代；
反应组9：1μl浓度为10μM的5’Phos-TE17加上1μl浓度为10μM的BP23-6G，再加上1μl 浓度为10μM的SST30B6C以及7μl的TE缓冲液(pH8.0)；
反应组10：反应组9中SST30B6C用SST30B1C-4I-3I3C替代；
反应组11：反应组9中SST30B6C用SST30B-5I1C-3I3C替代；
反应组12：反应组9中SST30B6C用SST30B-5I-4I4C替代；
上述12个反应组的连接反应和电泳检测同实施例1，结果见图4。
如图4所示：当脱氧次黄嘌呤I在连接位置旁边第4和3(“-4”和“-3”，也就是反应组2， 即图4中2所示泳道)碱基位或者在连接位置旁边第5和3(“-5”和“-3”，也就是反应组3， 即图4中3所示泳道)碱基位同时有2个替代而产生2个I:A配对时，对连接反应影响较大，目 的产物浓度较低，与没有脱氧次黄嘌呤I替代的反应(反应组1，即图4中1所示泳道)相比， 浓度有极大的降低，当2个替代位置在连接位置旁边第5和4(反应组4，即“-5”和“-4”，即 图4中4所示泳道)碱基位时，对连接反应影响有所减轻，目的条带浓度有所增加，但跟对照(也 就是没有替代，反应组1，即图4中1所示泳道)相比，连接产物浓度还是有较大降低；当脱氧 次黄嘌呤I在连接位置旁边第4和3(“-4”和“-3”，也就是反应组6，即图4中6所示泳道) 碱基位或者在连接位置旁边第5和3(“-5”和“-3”，也就是反应组7，即图4中7所示泳道) 碱基位同时有2个替代而产生2个I:T配对时，对连接反应影响非常大，目的产物浓度极低，当2 个替代位置在连接位置旁边第5和4(“-5”和“-4”，也就是反应组8，即图4中8所示泳道) 碱基位，对连接反应影响有所减轻，目的条带浓度有所增加，但跟对照(没有脱氧次黄嘌呤I替 代，也就是反应组5，即图4中5所示泳道)相比，浓度仍有极大的降低；当脱氧次黄嘌呤I在 连接位置旁边第4和3(“-4”和“-3”，也就是反应组10，即图4中10所示泳道)碱基位或者 在连接位置旁边第5和3(“-5”和“-3”，也就是反应组11，即图4中11所示泳道)碱基位同 时有2个替代而产生2个I:G配对时，基本完全抑制连接反应而没有目的产物，甚至当2个替代 位置在连接位置旁边第5和4(“-5”和“-4”，也就是反应组12，即图4中12所示泳道)碱基 位时，对连接反应影响仍然极大，目的条带浓度极其微弱，跟对照(也就是没有替代，反应组9， 即图4中9所示泳道)相比，连接产物浓度下降非常明显。
综上可见，当脱氧次黄嘌呤I在连接位置旁边第5、4和3位碱基位中任意2位同时有2个替 代时，对I:T、I:A和I:G配对下的Quick T4连接酶作用均有较大的影响，相对而言，在连接位置 旁边第5和4碱基位同时有2个替代时，对连接反应的影响最小。
实施例4脱氧次黄嘌呤I掺入提高寡脱氧核苷酸链的有效连接长度
5’Phos-TE 17：5’pATCGAAGAGCTGAGGCG3’；
BP23-6T：5’CGCCTCAGCTCTTCGATTTTTTT3’；
BP21-4T：5’CGCCTCAGCTCTTCGATTTTT3’；
BP23-5I-4I4T：5’CGCCTCAGCTCTTCGATIITTTT3’
SST30B6A：5’GTTCTAGAATCTTGATCACGCCTAAAAAAA3’；
用pH8.0的TE缓冲液(10mM三羟甲基胺基甲烷-盐酸Tris-HCl，1mM乙二胺四乙酸EDTA) 将以上寡核苷酸链均配制成浓度为10μM的溶液(用紫外分光光度计定浓度)，再配制以下4个 反应组：
反应组1：1μl浓度为10μM的5’Phos-TE17加上1μl浓度为10μM的BP23-6T，再加上1μl 浓度为10μM的SST30B6A以及7μl的TE缓冲液(pH8.0)；
反应组2：同反应组1；
反应组3：反应组1中BP23-6T用BP21-4T替代；
反应组4：反应组1中BP23-6T用BP23-5I-4I4T替代；
上述4个反应组的连接反应和电泳检测同实施例1(反应组2中不加入Quick T4连接酶作为 阴性对照)，结果见图5。
如图5所示：阴性对照(没有连接酶，也就是反应组2，即图5中1所示)没有连接产物； 当寡核苷酸链有效连接配对由6个A:T配对(反应组1，即图5中2所示)缩减为4个A:T配对 (反应组3，即图5中3所示泳道)时，连接产物浓度有很大下降；而当BP21-4T上重新掺入2 个脱氧次黄嘌呤I，使得寡核苷酸链有效连接配对重新从4个碱基配对(4个A:T配对，也就是反 应组3，即图5中3所示泳道)增加到6个碱基配对(2个A:I配对加4个A:T配对，也就是反应 组4，即图5中4所示泳道)时，连接产物浓度有很大提高，与对照(反应组1，也就是没有脱氧 次黄嘌呤I而全为自然碱基A:T配对，即图5中2所示泳道)相比，产物浓度变化不大，可见， 脱氧次黄嘌呤I可以提高寡核苷酸链有效连接长度。
实施例5连接时间对脱氧次黄嘌呤I掺入的I:A配对下连接反应的影响
为考察连接时间对脱氧次黄嘌呤I掺入下连接反应的影响，选用实施例1反应组13的条件(即 在连接位点旁边第3位点被脱氧次黄嘌呤I替代而形成“-3”位I:A配对)，Quick T4连接酶分 别在室温(25℃)下连接0、5、30、300和900min，65℃处理15min终止连接反应后，电泳检 测同实施例1，结果见图6。如图6所示：连接5min(泳道2)后，连接反应基本已完成，继续 延长连接反应，目的产物基本上没有进一步增加，甚至连接反应延长到900min(泳道5)后，产 物浓度也基本不变。可见，Quick T4连接酶能在5min左右完成有脱氧次黄嘌呤I掺入的I:A配 对下的连接反应。
实施例6连接酶量对脱氧次黄嘌呤I掺入的I:A配对下连接反应的影响
为考察连接酶量对脱氧次黄嘌呤I掺入下连接反应的影响，选用实施例1反应组13的条件(即 在连接位点旁边第3位被脱氧次黄嘌呤I替代而形成“-3”位I:A配对)，分别加入0、0.5U、1U、 2U和5U的Quick T4连接酶，在室温(25℃)下连接5min，65℃处理15min终止连接反应后， 电泳检测同实施例1，结果见图7。如图7所示：没有加入连接酶(图7中1所示泳道)的反应没 有形成目的产物，而加入0.5U(2所示泳道)、1U(3所示泳道)、2U(4所示泳道)和5U(5 所示泳道)的反应，均有较理想的连接产物，而且目的条带浓度基本不变。可见，0.5U的Quick T4连接酶就能在25℃下5min左右完成有脱氧次黄嘌呤I掺入的I:A配对下的连接反应。
实施例7连接温度对脱氧次黄嘌呤I掺入的I:A配对下连接反应的影响
为考察连接温度对脱氧次黄嘌呤I掺入下连接反应的影响，选用实施例1反应组13的条件(即 在连接位点旁边第3位被脱氧次黄嘌呤I替代而形成“-3”位I:A配对)，0.5U的Quick T4连接 酶分别在10℃、16℃、20℃、25℃和30℃下连接30min，65℃处理15min终止连接反应后， 连接反应和电泳检测同实施例1，结果见图8。如图8所示：在所考察的不同连接温度下，均有较 理想的连接产物，而且目的条带浓度基本不变。可见，Quick T4连接酶就能在比较宽的温度范围 内连接30min左右完成有脱氧次黄嘌呤I掺入的I:A配对下的连接反应。
SEQUENCE LISTING
<110> 浙江工业大学
<120> 脱氧次黄嘌呤在脱氧寡核苷酸链连接反应中的应用
<160> 10
<170> PatentIn version 3.4
<210> 1
<211> 17
<212> DNA
<213> Unknown
<223> 5'Phos-TE17
<400> 1
atcgaagagc tgaggcg 17
<210> 2
<211> 23
<212> DNA
<213> Unknown
<223> BP23-6G
<400> 2
cgcctcagct cttcgatggg ggg 23
<210> 3
<211> 30
<212> DNA
<213> Unknown
<223> SST30B6C
<400> 3
gttctagaat cttgatcacg cctacccccc 30
<210> 4
<211> 23
<212> DNA
<213> Unknown
<223> BP23-6A
<400> 4
cgcctcagct cttcgataaa aaa 23
<210> 5
<211> 30
<212> DNA
<213> Unknown
<223> SST30B6T
<400> 5
gttctagaat cttgatcacg cctatttttt 30
<210> 6
<211> 23
<212> DNA
<213> Unknown
<223> BP23-6T
<400> 6
cgcctcagct cttcgatttt ttt 23
<210> 7
<211> 30
<212> DNA
<213> Unknown
<223> SST30B6A
<400> 7
gttctagaat cttgatcacg cctaaaaaaa 30
<210> 8
<211> 23
<212> DNA
<213> Unknown
<223> BP23-6C
<400> 8
cgcctcagct cttcgatccc ccc 23
<210> 9
<211> 30
<212> DNA
<213> Unknown
<223> SST30B6G
<400> 9
gttctagaat cttgatcacg cctagggggg 30
<210> 10
<211> 21
<212> DNA
<213> Unknown
<223> BP21-4T
<400> 10
cgcctcagct cttcgatttt t 21
