一种L-氨基酸氧化酶活力的定量检测方法

（一）技术领域

本发明涉及一种L-氨基酸氧化酶活力的定量检测方法，尤其是一种利用二甲酚橙琼脂平板定量检测L-氨基酸氧化酶活力的方法。 

（二）背景技术

L-氨基酸氧化酶（L-amino acid oxidase，简称LAAO，酶学编号为：EC1.4.3.2）是一种以黄素腺嘌呤二核苷酸（FAD)或单核苷酸（FMN)为辅基的黄素类蛋白酶。该酶能特异性氧化L-氨基酸脱氨，生成α-酮酸、氨和过氧化氢（H₂O₂）。产物α-酮酸是有机合成、药物合成和生物合成的关键中间体，在医药、食品、饲料等行业有着重要的应用前景。近年来有文献报道LAAO本身具有抗菌、杀虫、抗病毒等生物活性，还具有与血小板相互作用、细胞毒性及诱导细胞凋亡的作用，因此，LAAO在生物医药等领域具有极其广阔的应用前景。 

LAAO分布较广，其不仅存在于蛇毒中，还广泛存在于真菌、细菌、放线菌、藻类等生物体中。目前检测LAAO活性的常用方法有两种，即荧光法和分光光度法。这两种方法均是依据测定由LAAO催化底物所生成的H₂O₂变化量来实现的。荧光法是依据LAAO催化L-氨基酸所产生的H₂O₂可使无荧光性的高香草酸等物质转变为有强烈荧光的物质的原理，根据反应体系荧光值的变化来测定LAAO酶活力。虽然该方法的精确度和灵敏度都很高，但该方法的荧光寿命短，容易淬灭，操作时需避免长时间暴露于光和空气中，而且反应体系中的蛋白质上某些氨基酸对测定有较大干扰。分光光度法是依据LAAO催化L-氨基酸所产生的H₂O₂可作用于色素原物质而使其在一定波长下产生吸光值的原理，根据反应体系吸光值的变化来测定LAAO酶活力。该方法对设备要求相对低，反应快，操作简单，重复 性好，是目前测定LAAO活性的最常用方法，但该方法中所用的色素原物质如邻联茴香胺（ODA）、邻苯二胺（OPD)和3,3′,5,5′－四甲基联苯胺(TMB)等灵敏性和稳定性相对较差，而且贵。目前，定量检测LAAO活力的主要方法是商品化的H₂O₂检测试剂盒，如美国Invitrogen公司的Amplex Red Hydrogen Peroxide/Peroxidase Assay kit。虽然该试剂盒比较灵敏、稳定，被广泛使用，但是，其对设备要求高，操作复杂，价格极其昂贵（每个反应大约要几十元人民币）。 

发明专利（余志良、周宁、裘娟萍；用普鲁士蓝平板定量测定L-氨基酸氧化酶活力的方法；申请号：201210284618.6；申请日：2012-08-10。）创建了一种新的简易的定量检测LAAO活力的方法，即普鲁士蓝琼脂平板法（Prussian Blue Agar），该方法是基于H₂O₂作为电子供体存在下，Fe³⁺和铁氰化钾混合液通过氧化还原反应产生蓝色沉淀的原理检测LAAO，即在含有Fe³⁺和铁氰化钾的琼脂平板（普鲁士蓝琼脂平板）上打孔，加入不同浓度的H₂O₂标准溶液，然后量取不同H₂O₂浓度下所产生的蓝色圈直径大小；根据H₂O₂浓度大小和蓝色圈直径大小来拟合标准曲线，得到拟合的方程。用待测的LAAO催化底物L-氨基酸产生H₂O₂而制备成待测液，然后将待测液加到普鲁士蓝琼脂平板上进行显色反应，量取所形成的蓝色圈直径，从拟合的方程得到待测液中所含有的H₂O₂浓度，由此确定LAAO的酶活力。该方法适用性广，而且极其方便、简单和经济，稳定性和可重复性也非常好。但是该方法的定量检测下限仅为500μmol/L的H₂O₂，灵敏度还不够高，不能被用来定量检测活性低的L-氨基酸氧化酶所产生的痕量H₂O₂，而且，该方法中所用到的物质铁氰化钾虽然本身毒性不大，但在强酸性等条件下，该物质会被分解，释放出CN^-,产生极大的毒害作用，将极大地危害操作人员和环境。因此，建立一种更灵敏、环境更友好、 简单方便、经济廉价、适用性广和可重复性佳的定量检测LAAO的方法，显得极为重要。 

二甲酚橙（xylenol orange）是一种酸碱指示剂，也是一种络合指示剂，当其与金属离子络合后，会由红色变为紫红色。Hermes-Lima等（Hermes-Lima M.，Willmore WG.，Storey KB.Quantification of lipid peroxidation in tissue extracts based on Fe(III)xylenol orange complex formation.Free Radic.Biol.Med.1995，19:271-280.）报道了一种用二甲酚橙检测H₂O₂的方法，该方法基于H₂O₂作为氧化剂存在下，Fe²⁺能被H₂O₂氧化为Fe³⁺，所生成的Fe³⁺能与二甲酚橙络合形成紫红色络合物（Fe(III)-xylenol）的原理。H₂O₂在普鲁士蓝和二甲酚橙两种检测H₂O₂浓度的方法中所起的作用是不一样的，前者是作为电子供体，后者是作为氧化剂。二甲酚橙检测H₂O₂的方法更灵敏，但是目前该方法主要是通过分光光度法来检测H₂O₂浓度，对设备要求高，而且检测通量小，步骤复杂、繁琐。到目前为止，还未见报道用二甲酚橙来检测LAAO酶活力作用所产生的H₂O₂浓度，更未见报道用二甲酚橙来定量检测LAAO酶活力。如何利用二甲酚橙能检测H₂O₂浓度来建立一种简单、灵敏、稳定、价廉的定量测定LAAO酶活力的方法显得极其重要。 

（三）发明内容

本发明目的是提供一种用二甲酚橙琼脂平板定量检测L-氨基酸氧化酶活力的方法，该方法具有灵敏度极高、成本低，操作简单且方便，稳定性好、环境友好等特点。 

本发明采用的技术方案是： 

一种利用二甲酚橙琼脂平板定量检测L-氨基酸氧化酶活力的方法， 所述方法包括： 

（1）二甲酚橙琼脂平板的制备：以水为溶剂，配制含有0.05～0.4mmol/L FeSO₄、0.04～0.3mmol/L二甲酚橙和15～30g/L琼脂的水溶液，煮沸溶解，倒平板，冷却凝固后制成二甲酚橙琼脂平板； 

（2）待测液的制备：以0.2～20mmol/L的L-亮氨酸为底物，加入含L-氨基酸氧化酶待测酶液作为酶源，于25～50℃、pH5～9条件下反应0.5～2h，获得的反应液用水经稀释（稀释的目的是使待测液中过氧化氢的浓度处于5～160μmol/L的有效范围内）后即为待测液；所述L-氨基酸氧化酶待测酶液为已知具有L-氨基酸氧化酶活性的酶液，可以是市购商品酶，也可以是已知具有L-氨基酸氧化酶活性的样品，包括蛇毒（例如东部菱背响尾蛇蛇毒等），或者能够产L-氨基酸氧化酶的真菌、细菌、放线菌、藻类等生物体（例如交替假单胞菌CGMCC NO.5353等）产生的酶液； 

（3）L-氨基酸氧化酶活力的测定：用打孔器在二甲酚橙琼脂平板上打出直径为4～10mm（优选为5～7mm，更优选为6mm）的小孔，然后往小孔中加入待测液，室温静置20～100min（优选为60min）后，测定紫红色圈的直径（包含小孔）； 

（4）标准曲线绘制：配制梯度浓度的过氧化氢溶液，按照步骤（3）方法进行检测，以过氧化氢浓度为横坐标、紫红色圈直径为纵坐标，绘制标准曲线； 

（5）结果判定：根据待测液的紫红色圈直径，对照标准曲线，获得 待测液中过氧化氢的浓度值，从而获得L-氨基酸氧化酶活力数据；L-氨基酸氧化酶活力的定义为：1μL酶液作用底物浓度为10mmol/L的L-氨基酸1h后释放出1mmol/L过氧化氢即为1个酶活单位U。 

优选的，步骤（1）所述二甲酚橙琼脂平板中FeSO₄浓度为0.20～0.30mmol/L，更优选为0.25mmol/L；二甲酚橙浓度为0.10～0.20mmol/L，更优选为0.15mmol/L；琼脂浓度为18～25g/L，更优选为20g/L。 

优选的，步骤（3）中每孔加入待测液30～70μL，更优选为50μL。 

优选的，所述L-氨基酸氧化酶待测酶液来自东部菱背响尾蛇（Crotalus adamanteus）。 

优选的，所述方法如下： 

（1）二甲酚橙琼脂平板的制备：将1mmol/L的FeSO₄水溶液、0.6mmol/L的二甲酚橙水溶液与40g/L的琼脂水溶液以体积比1:1:2混合，摇匀，煮沸溶解，倒平板，冷却凝固后制成二甲酚橙琼脂平板； 

（2）待测液的制备：在3mL、10mmol/L的L-亮氨酸底物溶液中，加入1μL的L-氨基酸氧化酶待测酶液作为酶源，于30℃、pH7.5条件下反应0.5h，获得的反应液用水稀释适当倍数即为待测液； 

（3）L-氨基酸氧化酶活力的测定：用打孔器在二甲酚橙琼脂平板上打出直径6mm的小孔，然后往小孔中加入50μL待测液，室温静置60min后，测定紫红色圈的直径； 

（4）标准曲线绘制：配制梯度浓度的过氧化氢溶液，按照步骤（3）方法进行检测，以过氧化氢浓度为横坐标、紫红色圈直径为纵坐标，绘制标准曲线； 

（5）结果判定：根据待测液的紫红色圈直径，对照标准曲线，获得待测液中过氧化氢的浓度值，从而获得L-氨基酸氧化酶活力数据。 

标准曲线制作及方程拟合过程为：以水为溶剂，配置浓度为5μmol/L、10μmol/L、20μmol/L、40μmol/L、60μmol/L、80μmol/L、100μmol/L、120μmol/L、160μmol/L、200μmol/L和250μmol/L的过氧化氢标准水溶液；各取50μL以上不同浓度的过氧化氢水溶液，加入到二甲酚橙琼脂平板的6mm小孔中，室温放置60min后，测定紫红色圈的大小；以过氧化氢浓度对数值为横坐标（X），紫红色圈直径为纵坐标（Y），用Origin作图软件绘制曲线；由Origin软件自动拟合出X-Y之间的关系方程式Y=2.040X-1.449，其中R²=0.997。 

本发明的有益效果主要体现在：本发明提供了一种用二甲酚橙琼脂平板定量检测L-氨基酸氧化酶活力的方法，所述方法的FeSO₄浓度、二甲酚橙浓度、检测时间和pH适用范围均比较广，灵敏度极高，可以定量检测浓度为5μmol/L的过氧化氢（与普鲁士蓝琼脂平板法相比灵敏度提高了100倍），而且操作简单方便，环境友好，成本低，稳定性好。 

（四）附图说明

图1为pH对过氧化氢作用下二甲酚橙琼脂显色的影响； 

图2为FeSO₄浓度对过氧化氢作用下二甲酚橙琼脂显色的影响； 

图3为二甲酚橙浓度对过氧化氢作用下二甲酚橙琼脂显色的影响； 

图4为反应时间对过氧化氢作用下二甲酚橙琼脂显色的影响； 

图5为过氧化氢浓度和二甲酚橙琼脂平板的紫红色圈直径之间的标准曲线及所拟合的方程式； 

图6为过氧化氢浓度对数值和二甲酚橙琼脂平板的紫红色圈直径之间的标准曲线及所拟合的方程式； 

图7为东部菱背响尾蛇L-氨基酸氧化酶（caLAAO）对L-Leu的活力。 

（五）具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此： 

实施例1：二甲酚橙琼脂平板的制备 

称取0.0278g FeSO₄溶于100mL的水，配成浓度为1mmol/L的FeSO₄溶液；称取0.046g二甲酚橙溶于100mL的水，配成浓度为0.6mmol/L的二甲酚橙溶液；称取8g琼脂溶于200mL的水，配成浓度为40g/L的琼脂水溶液；将上述100mL浓度为1mmol/L的FeSO₄溶液、100mL浓度为0.6mmol/L的二甲酚橙溶液和200mL浓度为40g/L的琼脂水溶液混合，摇匀，煮沸溶解后，倒入培养皿配置二甲酚橙琼脂平板20块；待琼脂冷却凝固后，用打孔器在二甲酚橙琼脂平板上打出直径为6mm的小孔（平板往往略显黄色）。以上所制备二甲酚橙琼脂平板中FeSO₄浓度为0.25mmol/L，二甲酚橙浓度为0.15mmol/L，琼脂浓度为20g/L。 

实施例2：pH对过氧化氢作用下二甲酚橙琼脂显色的影响 

（1）用6N的HCl水溶液和6N的NaOH水溶液混合，分别配制pH为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13和14的混合溶液，用移液器分别移取50μL的上述pH1～14的混合溶液，分别转入实施例1方法制备的二甲酚橙琼脂平板的小孔内（直径6mm），室温（25℃）放置60min后观察二甲酚橙琼脂显色结果，见图1第1行所示。 

从图1第1行可见，pH2及以下情况下，二甲酚橙琼脂平板产生了橘黄色圈，随着pH的下降，橘黄色圈变大，这主要是在强酸性条件下，作 为酸碱指示剂的二甲酚橙本身会显明显的橘黄色；在pH3～11情况下，二甲酚橙琼脂平板没有明显的颜色变化；而在pH12～14情况下，有紫红色圈产生，而且，随着pH的增加，紫红色圈变大，这主要是在强碱性条件下，作为酸碱指示剂的二甲酚橙本身会显紫红色。由此可见，检测溶液的pH在3～11之间时，对二甲酚橙琼脂平板没有明显的显色影响。 

（2）配置浓度均为50μmol/L但pH为1～14（用HCl或NaOH水溶液调节pH）的过氧化氢水溶液，依次取50μL，转入实施例1方法制备的二甲酚橙琼脂平板的小孔内（直径6mm），室温放置60min后观察二甲酚橙琼脂显色结果（图1第2行所示）。从图1第2行可见，当pH为3～11情况下，二甲酚橙琼脂平板上均形成了大小基本一致的紫红色圈，这是因为在过氧化氢作用下形成了二甲酚橙—Fe(III)紫红色络合物；而在pH为1～2情况下，过低的pH影响了过氧化氢对Fe²⁺的氧化作用，从而不能产生Fe³⁺，所以没有形成紫红色络合物；而且在pH1～2情况下，二甲酚橙琼脂平板产生了橘黄色圈，这主要是在强酸性条件下，作为酸碱指示剂的二甲酚橙本身会显明显的橘黄色；在pH12～14下，虽然也形成了紫红色圈，但所形成圈的大小与pH3～11条件下形成的不一样，这主要是由于在过碱条件下，二甲酚橙琼脂平板上所形成的紫红色圈不是因为过氧化氢对Fe²⁺进行氧化而形成紫红色络合物所导致的，而是由于二甲酚橙作为酸碱指示剂显色所产生的。由此可见，在pH3～11情况下，二甲酚橙琼脂平板能被用来检测过氧化氢。 

（3）用水配制浓度为50μmol/L的过氧化氢水溶液14份（pH均为7.5），分别取50μL，转入实施例1方法制备的二甲酚橙琼脂平板的14个小孔内（直径6mm），室温放60min后观察二甲酚橙琼脂显色结果（图1第3行所示）。从图1第3行可见，14个小孔周围均形成了大小基本一致的紫红色圈，这是因为在过氧化氢作用下Fe²⁺被氧化成为Fe³⁺，从而形 成了二甲酚橙—Fe(III)紫红色络合物。 

综上可见，在pH3～11条件下，二甲酚橙琼脂平板能被用来检测过氧化氢。 

实施例3：FeSO₄浓度对过氧化氢作用下二甲酚橙琼脂显色的影响 

在固定二甲酚橙浓度为0.15mmol/L和琼脂浓度为20g/L的条件下，按实施例1的方法制备FeSO₄浓度分别为0、0.05mmol/L、0.10mmol/L、0.15mmol/L、0.20mmol/L、0.25mmol/L、0.30mmol/L、0.35mmol/L和0.40mmol/L的不同二甲酚橙琼脂平板；然后用水配制浓度为50μmol/L的过氧化氢水溶液（pH为7.5），分别取50μL，转入以上所制备的含有不同FeSO₄浓度的二甲酚橙琼脂平板的小孔内（直径6mm），室温放60min后观察二甲酚橙琼脂显色结果，量取所产生的紫红色圈的直径大小（图2）。如图2所示，随着二甲酚橙琼脂平板中FeSO₄浓度的升高，所形成的紫红色圈的直径变大；当FeSO₄浓度达到0.25mmol/L时，紫红色圈的直径达到最大，继续增加FeSO₄浓度，紫红色圈的直径基本保持不变。由此可见，FeSO₄浓度会影响过氧化氢在二甲酚橙琼脂平板上所形成紫红色圈的大小，0.25mmol/L为最优的FeSO₄浓度。 

实施例4：二甲酚橙浓度对过氧化氢作用下二甲酚橙琼脂显色的影响 

在固定FeSO₄浓度为0.25mmol/L和琼脂浓度为20g/L的条件下，按实施例1的方法制备二甲酚橙浓度分别为0、0.04mmol/L、0.08mmol/L、0.10mmol/L、0.15mmol/L、0.20mmol/L、0.25mmol/L和0.30mmol/L的不同二甲酚橙琼脂平板；然后用水配制浓度为50μmol/L的过氧化氢水溶液（pH为7.5），分别取50μL，转入以上所制备的含有不同二甲酚橙浓度的二甲酚橙琼脂平板的小孔内（直径6mm），室温放60min后观察二甲 酚橙琼脂显色结果，量取所产生的紫红色圈的直径大小（图3）。如图3所示，随着二甲酚橙琼脂平板中二甲酚橙浓度的升高，所形成的紫红色圈的直径变大；当二甲酚橙浓度达到0.15mmol/L时，紫红色圈的直径达到最大，继续增加二甲酚橙浓度，紫红色圈的直径反而略微变小。由此可见，二甲酚橙浓度会影响过氧化氢在二甲酚橙琼脂平板上所形成紫红色圈的大小，0.15mmol/L为最优的二甲酚橙浓度。 

实施例5：反应时间对过氧化氢作用下二甲酚橙琼脂显色的影响 

按实施例1的方法制备FeSO₄浓度为0.25mmol/L、二甲酚橙浓度为0.15mmol/L和琼脂浓度为20g/L的二甲酚橙琼脂平板；然后用水配制浓度为50μmol/L的过氧化氢水溶液（pH为7.5），分别取50μL，转入以上所制备的二甲酚橙琼脂平板的小孔内（直径6mm），室温放置，分别反应10min、20min、30min、40min、50min、60min、70min、80min、90min和100min后观察二甲酚橙琼脂显色结果，量取所产生的紫红色圈的直径大小（图4）。如图4所示，随着过氧化氢在二甲酚橙琼脂平板上反应时间的延长，所形成的紫红色圈的直径变大；当反应时间达到60min时，紫红色圈的直径基本达到最大，继续增加反应时间，紫红色圈的直径只有略微增加。由此可见，过氧化氢在二甲酚橙琼脂平板上的反应时间会影响所形成的紫红色圈的大小；考虑到作用效率，60min是最优的反应时间。 

实施例6：不同过氧化氢浓度下二甲酚橙琼脂平板上的紫红色圈直径大小 

用水分别配制浓度为5μM、10μM、20μM、40μM、60μM、80μM、100μM、120μM、160μM、200μM和250μM的过氧化氢标准溶液（pH 均为7.5），各取50μL，转入实施例1方法制备的二甲酚橙琼脂平板的6mm直径小孔内（每个过氧化氢浓度做三个平行），室温放置60min后观察二甲酚橙琼脂显色结果，量取所形成的紫红色圈的直径（表1）。从表1可见，随着过氧化氢浓度的增加，二甲酚橙琼脂平板上所形成紫红色圈直径随之增加；均当过氧化氢浓度达到160μM，紫红色圈直径基本达到最大，进一步增加过氧化氢浓度，紫红色圈直径基本不再变化；而且三个平行实验之间的误差较小，说明实验的平行性较理想，方法比较稳定。以过氧化氢浓度为横坐标，二甲酚橙琼脂平板的紫红色圈直径为纵坐标，用Origin作图软件绘制标准曲线，结果如图5所示，标准曲线呈现指数形式；用作图软件自带工具进行方程式拟合后发现，方程式为Y=0.033e^X/0.211+0.246，其中R²=0.998，说明拟合良好。在过氧化氢浓度为5～160μM范围内，以过氧化氢浓度的对数值为横坐标（即X为lgC，C为过氧化氢浓度），二甲酚橙琼脂平板的紫红色圈直径为纵坐标（Y），用Origin作图软件拟合标准直线，结果如图6所示，用作图软件自带工具进行方程式拟合后发现，方程式为Y=2.040X-1.449，其中R²=0.997，说明线性关系良好。综上可见，在过氧化氢浓度为5～250μM范围内，过氧化氢浓度与二甲酚橙琼脂平板的蓝色圈直径有较好的对应关系，两者呈现较好的指数关系；尤其是在过氧化氢浓度为5～160μM范围内，过氧化氢浓度的对数值与二甲酚橙琼脂平板的紫红色圈直径大小有较好的线性关系。因此过氧化氢浓度大小可以通过二甲酚橙琼脂平板上紫红色圈直径大小来度量。 

表1：不同过氧化氢浓度下紫红色圈的直径大小 

实施例7：以L-Leu为底物时东部菱背响尾蛇L-氨基酸氧化酶的活力 

取1μL东部菱背响尾蛇L-氨基酸氧化酶（caLAAO，购买于Worthington Biochemical Corporation，USA）酶液，加至3mL的10mmol/L的L-亮氨酸（L-Leu）中，混匀，在温度30℃，pH7.5，反应30min，使L-氨基酸被氧化释放出过氧化氢，获得反应液，将反应液稀释360倍以后即为待测液；取50μL待测液加入到实施例1方法制备的二甲酚橙琼脂平板的6mm小孔内，室温放置60min后，测定紫红色圈的大小，结果如图7（左边孔）所示，紫红色圈直径为1.29cm（D=1.29cm），代入实施例6中所绘制的标准曲线Y=2.040X-1.449（图6），对数值换算后可求出待测液中的过氧化氢浓度约为17.3μM；用浓度为17.3μM的标准过氧化氢水溶液（pH7.5）按实施例6方法进行二甲酚橙琼脂平板显色实验进行验证，结果如图7（右边孔）所示，紫红色圈直径为1.30cm（D=1.30cm），验证值与实验值只有0.01cm（1.30-1.29=0.01）的偏差，说明二甲酚橙琼脂平板能准确反映实验结果。 

由此可见，1μL caLAAO催化氧化3mL浓度为10mmol/L的L-Leu后，所产生的过氧化氢浓度约为6.228mmol/L（17.3×360=6228μM）。根据酶活定义可知，caLAAO的活力为13.456U，这与用商品化的过氧化氢检测试剂盒（Amplex Red Hydrogen Peroxide/Peroxidase Assay kit，Invitrogen，USA）测定的14.1U的酶活力基本一致。