（一）技术领域
本发明涉及一株新型高效尼古丁降解菌，特别涉及一株新型高效假单 胞属尼古丁降解菌，即假单胞菌属HZN6及其应用。
（二）背景技术
尼古丁(nicotine)，俗称烟碱，是多种烟草中所特有的、最重要的生 物碱，约占烟草干重的1%-2%，是影响烟叶品质的重要因素之一，同时 也是烟叶和卷烟的主要有害成分之一。尼古丁的分子式为C10H14N2，结 构式如式（Ⅰ）所示。
因为尼古丁是一种精神药品，所以人类长期保持着吸食烟草的习惯。 然而尼古丁是烟叶和烟气中主要致癌成分烟草特有亚硝胺(TSNA)的重 要前体物，长期吸烟不仅会导致人体对尼古丁的依赖性，而且过量吸入会 抑制人体中枢神经，麻痹心脏，严重者会有致命的危险；同时，尼古丁也 是一种环境有毒物质，纯净的尼古丁在常温下是无色、味苦、有强烈刺激 性的油状液体，在空气中极易被氧化成暗灰色。烟气环境中就含有大量的 尼古丁,目前我国部分烟叶中尼古丁含量过高，尤其是在上部烟叶中的含 量普遍过高，这给烟叶生产带来很大挑战。同时，烟草在加工过程中会产 生浓度较高的尼古丁废料，这种废料被认为是“有毒的危险废物”，对环境 造成很大的危害。因此不断控制和降低卷烟中尼古丁的含量是国际烟草业 发展的必然趋势，也是降低吸烟危害的重要途径之一；同时降低环境中尼 古丁含量以及减少烟草废弃物对环境的污染对于维护人类健康有着深远 的意义。
尼古丁的化学结构和化学性质比较稳定，若用物理、化学的方法去除， 则成本较高，且有害副产品较多，还会影响到烟草原有的优良品质；而微 生物对烤烟中尼古丁的代谢具有独特的作用，利用微生物代谢方法去除尼 古丁，不仅成本低，有害副产品少，而且不影响烟草原有的优良特性，因 此有着广阔的应用前景。
微生物是一类种类多、繁殖快、适应性强、代谢能力强的生物体。若 能筛选分离出能高效降解尼古丁的微生物，将尼古丁降解成羧酸、氨基酸 等对人体和环境无毒害的物质，这对维护人类健康有着深远的意义。
（三）发明内容
本发明目的是提供一株新型高效假单胞属尼古丁降解菌HZN6及其 应用。
本发明采用的技术方案是：
假单胞菌属HZN6（Pseudomonas sp.HZN6），保藏于中国典型培养 物保藏中心，地址：湖北省武汉市珞珈山武汉大学，430072，保藏日期为 2010年8月9日，保藏号为CCTCC No:M2010196。
所述假单胞菌属HZN6的16S rDNA的Genbank登陆号为HQ108345。
假单胞菌属HZN6（Pseudomonas sp.HZN6）菌株的筛选与鉴定：
1）培养基
无机盐培养基终浓度组成为：每升培养液中含有NaCl 1g，K2HPO41.5g，KH2PO4 0.5g，（NH4）2SO4 1.5g，MgSO4 0.1g，1ml微量元素溶液， 溶剂为水，自然pH值，高压蒸汽灭菌（121℃，20min）后制得，其中每 升微量元素溶液中含MnSO4·H2O 0.13g，ZnCl2 0.23g，CuSO4·H2O 0.03g，CoCl2·6H2O 0.42g，Na2MoO4·2H2O 0.15g，AlCl3·6H2O 0.05g， 溶剂为水。
富集培养液：在无机盐培养液中加入尼古丁，使得尼古丁的终浓度为 200mg/L。
LB液体培养基：每升培养液中含有酵母粉10g，蛋白胨5.0g，氯化 钠10.0g，溶剂为水，自然pH值，高压蒸汽灭菌（121℃，20min）后制 得。
LB固体培养基：每升培养中含有酵母粉10g，蛋白胨5.0g，氯化钠 10.0g，琼脂15.0g，溶剂为水，自然pH值，高压蒸汽灭菌（121℃，20min） 后制得。
2）菌株分离纯化
污泥样品采自杭州农药厂，取5ml污泥样品置于250ml锥形瓶中， 加入100ml富集培养液，黑暗振荡培养（30℃，150rpm）1周，取5ml 上层浊液于新鲜的富集培养液100ml中，继续黑暗振荡培养（30℃， 150rpm）1周，重复上述操作过程3次，每次培养的接种物均取自于上次 培养所得的培养液。
取最后一次培养所得的培养液5ml进行梯度稀释（10-4、10-5、10-6）， 取各个稀释后的培养液150μl涂布于含500mg/L尼古丁的LB固体培养基 平板上，置于恒温培养箱（30℃）中培养，待平板上长出菌落后，挑取各 菌落于含500mg/L尼古丁的LB固体培养基平板上反复纯化，直至菌落单 一，将纯化后的各菌落分别接至LB液体培养基试管中振荡培养（30℃， 150rpm）过夜，将培养好的菌液离心（8000rpm，5min）后接至富集培养 液中25~45℃培养3d，通过高效液相色谱法（HPLC）检测各富集培养液 中尼古丁的残留量，最后筛选获得一株能高效降解尼古丁的菌株，命名为 HZN6。
3）菌株鉴定
将上述获得的菌株进行形态特征和分子生物学鉴定，该菌株的电镜照 片如图1所示。该菌株的主要生物学特征为：革兰氏染色反应阴性，菌体 杆状，端生鞭毛，无芽孢，大小约为(0.25~0.5)×(0.8~1.0)μm，菌落平 坦，中间凸起，边缘扩散，呈淡黄色，接触酶阳性，氧化酶阳性，甲基红 试验阳性，能利用β-环糊精、淀粉、葡萄糖、吐温40、乙酸盐，乙酰甲 基甲醇试验阴性，V.P.反应阴性。该菌株最适宜的生长条件为pH值7.0， 温度30℃。该菌株经16S rDNA序列分析鉴定为Pseudomonas属，因此 为假单胞菌属HZN6（Pseudomonas sp.HZN6）。
本发明提供一种所述假单胞菌属HZN6在降解尼古丁中的应用。
进一步，所述假单胞菌属HZN6在降解尼古丁中的应用是以尼古丁 为底物，以无机盐培养液为反应介质，以假单胞菌属HZN6为降解菌（即 酶），在25~45℃、pH值为5.5~9.0的条件下反应8~15h使反应液中尼古 丁的质量含量小于0.1%，达到降解尼古丁的目的。
进一步，所述的应用为：将无机盐培养液与尼古丁混合，使尼古丁终 浓度为100~3000mg/L（优选200mg/L），再加入含假单胞菌属HZN6的 细胞悬液构成反应体系，在25~45℃、pH值为5.5~9.0的条件黑暗振荡 培养直至反应液中尼古丁的质量残留量小于0.1%（通常培养8~15h）；所 述含假单胞菌属HZN6的细胞悬液加入量使反应体系中假单胞菌属HZN6 终浓度为1×107~5×109个/ml。
更进一步，所述假单胞菌属HZN6在降解尼古丁中的应用中含假单 胞菌属HZN6的细胞悬液的制备方法为：
（1）斜面培养：将假单胞菌属HZN6接种于斜面培养基，25~45℃ 培养5~7天，获得菌体斜面；所述斜面培养基的终浓度组成为：酵母粉 10g/L，蛋白胨5.0g/L，氯化钠10.0g/L，琼脂糖2.0g/L，溶剂为水；
（2）种子培养：从步骤（1）菌体斜面上挑取一接种环菌体接种至无 机盐培养基中，25~45℃培养5~7天，获得种子液；所述无机盐培养基终 浓度组成为：每升培养液中含有NaCl 1g，K2HPO4 1.5g，KH2PO4 0.5g， （NH4）2SO4 1.5g，MgSO4 0.1g，1ml微量元素溶液，溶剂为水，自然pH 值，高压蒸汽灭菌（121℃，20min）后制得，其中每升微量元素溶液中 含MnSO4·H2O 0.13g，ZnCl2 0.23g，CuSO4·H2O 0.03g，CoCl2·6H2O 0.42g，Na2MoO4·2H2O 0.15g，AlCl3·6H2O 0.05g，溶剂为水；
（3）扩大培养：将步骤（2）获得的种子液以体积浓度10~20%的接 种量接种至LB液体培养基中，30℃、150rpm振荡养至对数生长期，获 得菌液，将菌液离心，弃上清，沉淀用pH值为7.0的磷酸缓冲液悬浮， 获得含假单胞菌属HZN6的细胞悬液；所述LB液体培养基终浓度组成为： 每升培养中含有酵母粉10g，蛋白胨5.0g，氯化钠10.0g，溶剂为水，自 然pH值。
更进一步，所述假单胞菌属HZN6在降解尼古丁中的应用为：将无 机盐培养液与尼古丁混合，使尼古丁终浓度为200mg/L，再加入所述的 含假单胞菌属HZN6的细胞悬液构成反应体系，在30℃，pH7.0、150rpm 条件下黑暗振荡培养8h，使反应液中尼古丁的质量残留量小于0.1%，达 到降解尼古丁的目的；所述含假单胞菌属HZN6的细胞悬液的加入量使 反应体系中假单胞菌属HZN6终浓度为1×107~5×109个/ml，优选 1×107~5×107个/ml。
本发明菌体生长量采用紫外分光光度计来检测，通过测量菌体（即含 菌细胞培养液）在600nm处的吸光度值来表示。
本发明采用反相高效液相色谱法检测无机盐培养液中尼古丁的残留 量。反相高效液相色谱检测条件：流动相为甲醇：1mM H2SO4=10:90（体 积比），分析柱为Grace Alltima C18色谱柱(4.6×250mm，5μm)，流速为 0.6ml/min，进样量为20μl，柱温为30℃。
与现有技术相比，本发明的有益效果主要体现在：
本发明所述假单胞菌属HZN6可通过直接投加的方式应用于水体和 土壤中尼古丁的降解，能安全、高效、快速的降解水体、土壤等物体上残 留的尼古丁，含有该菌株的菌剂制备工艺简单，成本低廉，使用方便，具 有很好的应用前景。
（四）附图说明
图1为本发明假单胞菌属HZN6的电镜图；
图2为尼古丁的标准曲线图；
图3为本发明的假单胞菌属HZN6在不同温度下对尼古丁的降解曲 线图：正方形（■）为30℃，圆形（●）为25℃，正三角形（▲）为 37℃，倒三角形
为45℃；
图4为本发明的假单胞菌属HZN6在不同pH下对尼古丁降解影响 图；
图5为本发明的假单胞菌属HZN6在纯培养条件下对终浓度为 200mg/L的尼古丁的降解曲线图；
图6为本发明的假单胞菌属HZN6在尼古丁终浓度为200mg/L纯培 养条件下的生长曲线图；
图7为本发明的假单胞菌属HZN6对不同浓度尼古丁的降解曲线图。
（五）具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围 并不仅限于此：
实施例1：菌株的筛选与鉴定
1）培养基
无机盐培养基的配制：NaCl 1g，K2HPO4 1.5g，KH2PO4 0.5g，（NH4） 2SO4 1.5g，MgSO4 0.1g，1ml微量元素溶液，蒸馏水补足至1000ml，混 合后搅拌均匀，自然pH值，高压蒸汽灭菌（121℃，20min）后制得，其 中每升微量元素溶液中含MnSO4·H2O 0.13g，ZnCl2 0.23g，CuSO4·H2O 0.03g，CoCl2·6H2O 0.42g，Na2MoO4·2H2O 0.15g，AlCl3·6H2O 0.05g， 用蒸馏水补足至1000ml。
富集培养液：在无机盐培养液中加入尼古丁，使得尼古丁的终浓度为 200mg/L。
LB液体培养基的配制：酵母粉10g，蛋白胨5.0g，氯化钠10.0g，蒸 馏水补足至1000ml，混合后搅拌均匀，自然pH值，高压蒸汽灭菌（121℃， 20min）后制得。
LB固体培养基的配制：酵母粉10g，蛋白胨5.0g，氯化钠10.0g，琼 脂15.0g，蒸馏水补足至1000ml，混合后搅拌均匀，自然pH值，高压蒸 汽灭菌（121℃，20min）后制得。
2）菌株分离纯化
污泥样品采自杭州农药厂，取5ml污泥样品置于250ml锥形瓶中， 加入100ml富集培养液，黑暗振荡培养（30℃，150rpm）1周，取5ml 上层浊液于新鲜的富集培养液中，继续黑暗振荡培养（30℃，150rpm）1 周，重复上述操作过程3次，每次培养的接种物均取自于上次培养所得的 培养液。
取最后一次培养所得的培养液5ml进行梯度稀释（（10-4、10-5、10-6）， 取各个稀释后的培养液150μl涂布于含500mg/L尼古丁的LB固体培养基 平板上，置于恒温培养箱（30℃）中培养，待平板上长出菌落后，挑取各 菌落于含500mg/L尼古丁的LB固体培养基平板上反复纯化，直至菌落单 一，将纯化后的各菌落分别接至LB液体培养基试管中振荡培养（30℃， 150rpm）过夜，将培养好的菌液离心后接至富集培养液中培养3d，通过 反相高效液相色谱法检测各富集培养液中尼古丁的残留量，最后筛选获得 一株能高效降解尼古丁的菌株，命名为HZN6。
3）菌株鉴定
将上述获得的菌株进行形态特征和分子生物学鉴定，该菌株的电镜照 片如图1所示。该菌株的主要生物学特征为：菌体杆状，端生鞭毛，无芽 孢，大小约为(0.25~0.5)×(0.8~1.0)μm，菌落平坦，中间凸起，边缘扩 散，呈淡黄色，革兰氏染色反应阴性，接触酶阳性，氧化酶阳性，甲基红 试验阳性，能利用β-环糊精、淀粉、葡萄糖、吐温40、乙酸盐，乙酰甲 基甲醇试验阴性，V.P.反应阴性。该菌株最适宜的生长条件为pH值7.0， 温度30℃。该菌株经16S rDNA序列分析鉴定为Pseudomonas属，因此 为假单胞菌属HZN6（Pseudomonas sp.HZN6）。
实施例2：含菌细胞悬液的制备
（1）斜面培养：将假单胞菌属HZN6接种于斜面培养基，30℃培养 6天，获得菌体斜面；所述斜面培养基的终浓度组成为：酵母粉10g，蛋 白胨5.0g，氯化钠10.0g，琼脂糖2.0g，水1000ml；
（2）种子培养：从步骤（1）菌体斜面上挑取一接种环菌体接种至无 机盐培养基中，30℃培养6天，获得种子液；所述无机盐培养基终浓度组 成同实施例1；
（3）扩大培养：将步骤（2）获得的种子液以体积浓15%的接种量 接种至LB液体培养基（100mL）中，30℃、150rpm振荡培养至对数生 长期，获得菌液，将菌液离心（8000rpm，5min），弃上清，沉淀用pH值 为7.0的磷酸缓冲液悬浮，获得含假单胞菌属HZN6细胞悬液100mL， 其中细胞悬液中的假单胞菌属HZN6浓度为1×109个/ml；所述LB液体培 养基终浓度组成同实施例1；pH为7.0的0.2mol/L的磷酸缓冲液的配方 为：取0.2mol/L的磷酸二氢钠39ml和0.2mol/L的磷酸氢二钠61ml，用 超纯水定容至1000ml，高压蒸汽灭菌（121℃、20min）后即得。
实施例3：尼古丁降解实验
1）无机盐培养液中菌体浓度与尼古丁含量的检测：
菌体生长量采用紫外分光光度计来检测，通过测量培养液中菌体在 600nm处的吸光度值来表示。
本实验采用反相高效液相色谱法检测无机盐培养液中尼古丁的残留 量。反相高效液相色谱检测条件：流动相为甲醇：1mM H2SO4=10:90（体 积比），分析柱为Grace Alltima C18色谱柱(4.6×250mm，5μm)，流速为 0.6ml/min，进样量为20μl，柱温为30℃。
2）尼古丁降解实验：
将尼古丁标准品用无菌水溶解配制成100mg/L的标准液，在反相液 相色谱测试标准曲线，尼古丁标准曲线如图2所示，标准曲线方程为 y=5.4964x+6.8301，R2=0.9929，y为峰面积，x为尼古丁浓度。
a、不同温度对降解的影响：取250ml锥形瓶，分别加入100ml无机 盐培养液，高压蒸汽灭菌（121℃，20min）后加入尼古丁，使尼古丁终 浓度均为200mg/L，各取实施例2方法获得的含菌细胞悬液5ml，分别接 种于此无机盐培养液中，使假单胞菌属HZN6终浓度为5×107个/ml，分 别于25、30、37、45℃培养摇床（pH7.0，150rpm），每小时定时取样测 定残留尼古丁浓度，结果如图3所示，30℃为最适降解温度。
b、不同pH对降解的影响：取250ml锥形瓶，分别加入100ml无机 盐培养液，高压蒸汽灭菌（121℃，20min）后加入尼古丁，使尼古丁终 浓度均为200mg/L，各取实施例2方法获得的含菌细胞悬液5ml，分别接 种于此无机盐培养液中，使假单胞菌属HZN6终浓度为5×107个/ml，分 别调节pH至5.5、6.5、7.0、7.5、8.0和9.0，在30℃、150rpm下摇 床培养，每小时定时取样测定残留尼古丁浓度，结果如图4所示，pH7.0 为最适降解pH。
c、不同时间对降解的影响：取250ml锥形瓶，加入100ml无机盐培 养液，高压蒸汽灭菌（121℃，20min）后加入尼古丁，使尼古丁终浓度 为200mg/L，共设置3个平行样。各取实施例2方法获得的含菌细胞悬 液5ml，分别接种于此无机盐培养液中，使假单胞菌属HZN6终浓度为 5×107个/ml，相应的设置3个不含该菌种的平行实验作为空白对照，然后 一同置于摇床（30℃，pH7.0，150rpm）中黑暗振荡培养。在培养时间为 0、2、4、6、8h时定时取样，根据上述检测方法来检测无机盐培养液中 菌体的生长量与尼古丁的残留量，结果见图5所示。
本发明菌株对200mg/L浓度的尼古丁的降解曲线如图5所示，菌体 的生长曲线如图6所示，图6可以看出OD600从0.25增加到0.5，说明菌 体生长良好，观察图5，可以发现，培养8h后，本发明的尼古丁降解菌 对200mg/L的尼古丁的降解率接近为100%，所有未加菌的空白对照在 8h后的水解率均小于5%。
d、对不同浓度尼古丁降解的影响：
取250ml锥形瓶，分别加入100ml无机盐培养液，高压蒸汽灭菌 （121℃，20min）后加入尼古丁，使尼古丁终浓度分别为200、500、1000、 2000、3000mg/L，各取实施例2方法获得的含菌细胞悬液5ml，分别接 种于此无机盐培养液中，使假单胞菌属HZN6终浓度为5×107个/ml，在 pH7.0、30℃、150rpm下摇床培养，每小时定时取样测定残留尼古丁浓 度，结果如图7所示。
本发明菌株对浓度为100-3000mg/L的尼古丁的降解率如图7所示， 结果表明都具有非常好的降解能力，而且此菌种为新型尼古丁降解菌，因 此，该菌对研究尼古丁的降解途径与降解基因具有非常大的促进作用，对 环境中尼古丁的降解尤其是对尼古丁的集中修复具有一定的积极意义。
