（一）技术领域
本发明涉及一种酰胺类化合物降解酶ACE123、编码基因及应用。
（二）背景技术
酰胺类化合物是指氨或胺的氮原子上的氢被酰基取代后生成的化合 物。酰胺也可以看作羧酸分子中的羟基被氨基或胺苯基取代后生成的化合 物。常见的有甲酰胺(HCO-NH2)，乙酰胺[CH3-CO-NH2]，碳酰胺[CO-(NH2)2] 等。比如酰胺类除草剂就是一类典型的酰胺类化合物。该类除草剂种类繁 多，以含有酰胺基的除草剂品种而言，已达50余种；在全世界的年产量、 应用范围和使用面积仅次于有机磷除草剂，居第2位。在国际市场中，销 量最大的酰胺类除草剂品种是乙草胺、丁草胺、甲草胺，占该类除草剂总 产量的96%。从结构分，酰胺类除草剂又可分为苯氧丙酰胺、烃基酰胺、 芳基酰胺、磺酰胺和氯乙酰胺等。酰胺类除草剂具有中等到较高的水溶性 及相对较低的土壤吸附常数，所以施到农田的酰胺类除草剂，容易通过渗 透转移到浅层地下水或随雨水径流进入地表水而造成环境污染。酰胺类除 草剂的除草效果好，但同时也给环境安全带来了严重的威胁，所以寻求一 种有效的对酰胺类化合物污染治理技术显得十分必要且紧迫。
微生物法处理有机化合物污染以其廉价、无二次污染等优点为多数学 者所提倡，而现阶段多数研究集中在筛选出可以降解某一种该类化合物的 菌株及其降解特性上，对降解这一类化合物分子机制的研究较少。本发明 从一株菌株中克隆出可以断裂酰胺键酶的编码基因，该基因具有新颖性。 利用常规技术方法，设计引物，构建了表达载体，纯化出了一种酰胺酶， 该酶对乙草胺等酰胺类化合物具有较高的活性，可以有效的去除该类污染 物或者用于对该类物质的绿色转化；所述新的酰胺酶基因为构建更高效且 广谱的酰胺类污染物降解工程菌提供了保障。
（三）发明内容
本发明目的是提供一种对酰胺类化合物具有广谱且高效降解能力的 酶ACE123及其编码基因；同时提供该酰胺类化合物降解酶的应用。
本发明采用的技术方案是：本发明提供一种来源于申氏杆菌（Shinella sp.）HZA2的酰胺类化合物降解酶ACE123，所述降解酶ACE123的氨基 酸序列为SEQ ID No.1所示。
由于氨基酸序列的特殊性，任何SEQ ID No.1所示氨基酸序列的多肽 的片段或其变体，如其保守性变体、生物活性片段或衍生物，只要该多肽 的片段或多肽变体与前述氨基酸序列同源性在95%以上，均属于本发明 保护范围之列。具体的，所述改变可包括氨基酸序列中氨基酸的缺失、插 入或替换；其中，对于变体的保守性改变，所替换的氨基酸具有与原氨基 酸相似的结构或化学性质，如用亮氨酸替换异亮氨酸，变体也可具有非保 守性改变，如用色氨酸替换甘氨酸。
本发明还涉及一种所述酰胺类化合物降解酶ACE123的编码基因 ace123，所述编码基因ace123的核苷酸序列为SEQ ID No.2所示。由于 核苷酸序列的特殊性，任何SEQ ID NO.2所示多核苷酸的变体，只要其 与该多核苷酸具有90%以上同源性，均属于本发明保护范围之列。所述 多核苷酸的变体是指一种具有一个或多个核苷酸改变的多核苷酸序列。此 多核苷酸的变体可以使生的等位变异体或非生的变异体，包括取代变异 体、缺失变异体和插入变异体。如本领域所知的，等位变异体是一个多核 苷酸的替换形式，它可能是一个多个核苷酸的取代、缺失或插入，但不会 从实质上改变其编码的氨基酸的功能。
本发明涉及一种含有所述编码基因ace123的重组载体。
本发明提供一种用所述重组载体转化得到的重组基因工程菌。
本发明所述酰胺类化合物降解酶ACE123的编码基因ace123在制备 重组酰胺类化合物降解酶ACE123中的应用，具体所述的应用为：构建含 有所述编码基因ace123的重组载体，将所述重组载体转化至大肠杆菌中， 获得的重组基因工程菌进行诱导培养，培养液分离得到含有重组酰胺类化 合物降解酶ACE123的菌体细胞。
本发明的要点在于提供了SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列和SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列，在已知该核苷酸序列和氨基酸序列的情况下， 该核苷酸序列和氨基酸序列的获得，以及相关载体、宿主细胞的获得，对 于本领域技术人员来说均是显而易见的。
本发明还提供一种所述酰胺类化合物降解酶ACE123在降解酰胺类 化合物中的应用，所述的应用为：
（1）将含有酰胺类化合物降解酶ACE123编码基因的重组基因工程 菌接种至含终浓度50mg/L卡那霉素的LB液体培养基，32～37℃培养8h 后，以体积比1：50的接种量转接到100mL含终浓度50mg/L卡那霉素 的LB液体培养基中，32～37℃培养至OD600达到0.5，加入IPTG（即异 丙基硫代半乳糖苷）并使其终浓度为0.3～0.5mM，20～25℃诱导培养8～12 h，诱导培养结束后将培养液离心，收集湿菌体，再将湿菌体超声破碎， 离心，取上清液利用Ni-NTA纯化树脂分离纯化，收集流出液，流出液减 压浓缩去除洗脱剂，获得酰胺类化合物降解酶ACE123；（2）以酰胺类化 合物为底物，以步骤（1）制备的酰胺类化合物降解酶ACE123为催化剂， 于pH值为8的PBS缓冲液中构成转化体系，在37℃下转化反应2h， 向反应液中添加质量浓度6mol/L的盐酸水溶液（盐酸水溶液的用量对本 发明没有影响，能够抑制酶活即可，通常优选加入反应液体积的0.1～0.5 倍）终止反应，将反应液用乙酸乙酯萃取，取乙酸乙酯层获得含有降解产 物的混合液，将混合液提纯（根据底物和产物的种类，采用本领域公知的 分离提取方法进行），获得降解产物。
本发明在37℃下转化反应2h后，向反应液中加入6mol/L的盐酸水 溶液终止反应，然后乙酸乙酯萃取三次，取乙酸乙酯层用氮气吹干后无水 甲醇定容至1ml，采用HPLC方法检测降解产物含量。HPLC检测条件： 流动相为V（CH3OH）︰V（H2O）=80︰20，分析柱为Grace Alltima C18 Column(4.6mm×250mm，5μm)，检测波长279nm，柱温30℃，流速 0.8mL/min，进样量20μL。
进一步，优选所述酰胺类化合物为对乙酰氨基酚、2-乙基-6甲基--N- 乙氧基甲基-α-氯代乙酰替苯胺、N-(3',4'-二氯苯基)丙酰胺或3-氯氨基甲酸 异丙基酯。
进一步，优选所述反应体系中，底物的初始浓度为10mg/L，催化剂 用量为1mg/L。
进一步，步骤（1）所述分离纯化的方法为：重组蛋白可通过Ni-NTA Resin（Novagen）进行纯化。将上清液加到纯化柱子，调节样品下流的流 速为1mL/min，上样开始后，收集过滤液，保存（如果目的蛋白结合到 柱子上较少，则部分存在于穿过液中，可重复过柱子）。依次用20倍柱床 体积的结合液、咪唑终浓度为20mM的结合液、咪唑终浓度为40mM的 结合液洗涤柱床，关闭流速阀，加入10倍柱床体积的咪唑浓度为300mM 的结合液，搅动柱床，浸泡20min，打开流速阀，收集流出液，将流出 液减压浓缩去除洗脱剂，获得纯化后的蛋白，即为酰胺类化合物降解酶 ACE123。所述结合液为25mL的4M的NaCl水溶液，4mL的1M Tris 水溶液（pH8）和1mL的1M的咪唑水溶液，用去离子水定容到200mL 配制而成。
与现有技术相比，本发明的有益效果主要体现在：
本发明所提供的酰胺类化合物降解酶ACE123具有高效且广谱降解 酰胺类化合物的能力，为酰胺类化合物污染的修复提供了可靠的途径。所 述基因的提出为酰胺类污染物高效降解工程菌株的构建提供基础。
（四）附图说明
图1含ace123基因阳性克隆LB培养基生长图，点A即为阳性克隆。
图2克隆ace123基因的转化子对对乙酰氨基酚降解紫外图，曲线a、 曲线b、曲线c分别表示0h、6h、12h转化子对对乙酰氨基酚降解紫外 曲线。
图3实施例1中表达ace123基因的转化子质粒电泳图，泳道M为 DNA marker，泳道2为转化子质粒。
图4实施例2中表达蛋白ACE123的SDS-PAGE检测图，泳道M为 蛋白marker，泳道1为ACE123。
图5表达蛋白ACE123对几种底物降解活性，A为对乙酰氨基酚，B 为2-乙基-6甲基--N-乙氧基甲基-α-氯代乙酰替苯胺，C为N-(3',4'-二氯苯 基)丙酰胺，D为3-氯氨基甲酸异丙基酯。
（五）具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围 并不仅限于此：
实施例1基因ace123的克隆
本研究以对乙酰氨基酚为底物，采用鸟枪法构建菌株HZA2的DNA 基因文库，克隆出能断裂酰胺键的功能基因。
（1）总DNA的提取
申氏杆菌（Shinella sp.）HZA2（见申请号：CN201210460684.4），保 藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日期为2012年10月15日，地址： 湖北省武汉市珞珈山武汉大学，430072，保藏号为：CCTCCM2012405。
用高盐法提取细菌总DNA。取培养至对数期的菌液，12000r/min离 心收集菌体；用TE缓冲液（10mM Tris·HCl，0.1mM EDTA(pH8.0)）洗 涤菌体2遍后以1.5mL TE缓冲液悬浮菌体，同时加入120μL10%(W/V) 的SDS和12μL蛋白酶K(20mg/mL)于37℃水浴锅中水浴1～2h，再加入 1/3体积的饱和NaCl水溶液剧烈振荡15s，12000r/min离心5min，将上 清液转移到新的离心管内，用体积比1:1的酚：氯仿抽提三次，直至界面 上无白色沉淀，12000r/min离心收集上清液，加入2倍体积的冰冷无水 乙醇沉淀DNA，12000r/min离心收集总DNA，且用体积浓度70%乙醇 水溶液洗涤2次。待乙醇完全挥发后加入30μL TE缓冲液，放置于4℃ 环境过夜使之溶解后保存在-20℃冰箱，即为申氏杆菌HZA2的总DNA。
（2）酶切体系的建立
用限制性内切酶Sau3AI酶切申氏杆菌HZA2总DNA，调整酶浓度 和反应时间，以将总DNA切成合适大小的条带。酶切体系如下：
酶切产物用凝胶回收试剂盒根据操作说明书进行，获得DNA片段。 （3）酶连转化及阳性克隆的筛选
酶连体系：以载体pUC118为克隆载体（已经用BamHⅠ酶切，并已 经过脱磷处理），将1μg载体pUC118和6倍摩尔量的DNA片段转移到 无菌微量离心管中，补水至8.5μL；1μL10×T4连接酶缓冲液；0.5μL T4 DNA Ligase；最终补水至10μL，16℃连接12小时，获得酶连产物。
取200μL的E.coli DH5α感受态细胞，冰浴中解冻，将其转移到灭 菌离心管里，每管加10μL的酶连产物，轻轻旋转混匀；冰浴30min后 42℃水浴热激90s，后将离心管快速移到冰水中进行冰浴冷却1～2min， 整个过程应轻缓。每管加入800μL预热到37℃的LB液体培养液，37℃ 低速（80r/min）温育45min，使质粒抗性表达。取100μL已转化好的菌 液涂布在含有50mg/L氨苄和200mg/L对乙酰氨基酚的LB平板上，37℃ 倒置培养24h，选择得到产生红色产物的菌落，即为阳性克隆。本研究中 从约10000个转化子中筛选得到一个阳性克隆，将点到含有50mg/L氨苄 和200mg/L对乙酰氨基酚的LB平板上验证性状，如图1所示。
（4）测序
阳性克隆相关序列由上海英骏生物技术有限公司协助测序。用 BioEdit，Omiga等软件将测序得到的DNA序列进行剪切和拼接，利用 ORF Finder功能分析开放阅读框。利用BLAST功能在GenBank中进行 ORF的同源性比较。测序结果显示阳性克隆核苷酸序列为SEQ ID No.2 所示，对应的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。
（5）ace123基因的扩增和功能验证
根据上述阳性克隆核苷酸序列的测序结果分析，设计出一对引物来扩 增ace123基因，引物由上海生工生物工程公司合成。
引物1：5-TCCATGTAGCAAGTAGCATCAT-3
引物2：5-CTGAGATTGATGATGCCCATC-3
以所述申氏杆菌HZA2总DNA为模板，进行PCR扩增反应。反应 条件如下：
PCR反应体系（50μL）：DNA模板1μL，dNTP(25mmol/L)4μL， 引物（25μmol/L）各2μL，10×Buffer5μL，Mg2+(25mmol/L)4μL，Taq 酶（5U/μL）0.5μL和31.5μL的超纯水。PCR反应程序：94℃，4min； 94℃，1min；55℃，30s；72℃，1.5min；循环30次，72℃延伸10min。
转化：PCR获得大小约为1.4kb的基因片段。将回收得到的PCR片 段酶连到pMD18-T载体上，转化到E.coli DH5α感受态细胞中，涂布到 含有终浓度100mg/mL氨苄的固体LB培养基平板上，于37℃倒置培养， 12～16h后可出现菌落，获得含ace123基因的重组菌。挑取菌落重新点 到新鲜的含有终浓度100mg/mL氨苄液体LB液体培养基上，37℃，200 r/min培养24h，取菌液提取质粒测序，证明了基因ace123成功插入E.coli DH5α细胞。
接种此含ace123基因的重组菌至LB液体培养基，37℃培养至对数 期，按1:50体积比接种至新的LB液体培养基，培养至OD600≈2.0。10000 r/min离心收集菌体，用无机盐培养基配成OD600=10的种子液。按1:50的体 积比接种至含200mg/L对乙酰氨基酚的无机盐培养基中，37℃反应6h 后，12000r/min离心取上清液，过孔径为0.45μm的水系过滤膜，滤液用 高效液相色谱法（HPLC）检测剩余底物含量。HPLC检测条件：流动相 为V（CH3OH）︰V（H2O）=80︰20，分析柱为Grace Alltima C18Column (4.6mm×250mm，5μm)，检测波长279nm，柱温30℃，流速0.8mL/min， 进样量20μL。
用上述方法检验其对底物对乙酰氨基酚的降解功能。该重组菌对对乙 酰氨基酚具有很强的降解能力，6h对100mg/L的对乙酰氨基酚降解率接 近100%（图2）。
所用培养基和主要材料、试剂如下：
无机盐培养基(g/L)：NaCl1.0，K2HPO41.5，KH2PO40.5，（NH4）2SO41.5，MgSO40.1，1ml微量元素溶液，溶剂为去离子水，自然pH值，高 压蒸汽灭菌（121℃，20min）后制得。
LB液体培养基(g/L)：酵母粉10.0，蛋白胨5.0，氯化钠10.0， 溶剂为去离子水，自然pH值，高压蒸汽灭菌（121℃，20min）后制得。
LB固体培养基：向LB液体培养基中加入1.5%的琼脂粉，高压蒸汽 灭菌（121℃，20min）后制得。
DNA清洁回收试剂盒和DNA凝胶回收试剂盒购自杭州爱思进生物技 术有限公司；其他分析纯试剂以及实验所用到的几种抗生素均购自上海捷 倍思公司。
宿主菌E.coli DH5α和E.coli BL21(DE3)、感受态、载体pMD18-T、 PET-29a和pUC118、T4连接酶、各种限制性内切酶以及Taq DNA聚合酶等 均购自大连宝生物公司。
实施例2基因ace123在大肠杆菌中的表达和鉴定
（1）表达载体的构建
根据实施例1中的编码基因测序结果（SEQ ID No.2所示）设计引物， 引物包含酶切位点（NdeI，XhoI），引物如下：
引物1（NdeI）：
5-ACTGACTGCTCATATGCTGTCTTCACTGGGTTTTC-3
引物2（XhoI）：
5-ACTGCTCGAGTGGTCCTCCCAACAGGCT-3
以实施例1所述申氏杆菌HZA2总DNA为模板，进行PCR扩增反 应。反应条件如下：
PCR反应体系（50μL）：DNA模板1μL，dNTP(25mmol/L)4μL， 引物（25μmol/L）各2μL，10×的Buffer5μL，Mg2+(25mmol/L)4μL， Taq酶（5U/μL）0.5μL和31.5μL的超纯水。PCR反应程序：94℃，4min； 94℃，1min；58℃，30s；72℃，1.5min；循环30次，72℃延伸10min。
将PCR片段用NdeI和BamH I酶切4h，酶切后用凝胶回收试剂盒回 收目的片段，与经过同样双酶切处理的pET29a载体通过T4连接酶连接， 从而获得重组表达载体pET29a-ace123。参照实施例1转化步骤（抗生素 用卡那霉素），将表达载体pET29a-ace123导入E.coli DH5α细胞。使用菌 落质粒测序的方法检测转化结果，筛选出正确导入pET29a-ace123的转化 子，构建成功的载体电泳图，如图3所示。
（2）蛋白的诱导表达与纯化
将鉴定正确的重组质粒转化至E.coli BL21(DE3)感受态细胞。挑取单 菌落接种至含50mg/L卡那霉素的LB液体培养基，35℃培养8h后转接 到100mL含50mg/L卡那霉素的LB液体培养基中，35℃培养至其OD600达到0.5，加入IPTG并使其终浓度为0.4mM，20℃诱导培养12h。将培 养液高速离心收集菌体，用事先4℃预冷的双蒸水悬浮洗涤细胞两遍，然 后用适量的4℃预冷磷酸盐缓冲液PBS（20mM，pH7.5）悬浮菌体细胞。 20000Hz超声破碎5min，12,000r/min于4℃离心10min，留上清液。
重组蛋白通过Ni-NTA Resin（Novagen）进行纯化，将收集的上清液 加到Ni-NTA纯化柱子，调节流速约为1mL/min，上样开始后，收集过滤 液。依次用20倍柱床体积的结合液、咪唑终浓度为20mM的结合液、咪 唑终浓度为40mM的结合液洗涤柱床，关闭流速阀，加入10倍柱床体积 的咪唑浓度为300mM的结合液，搅动柱床，浸泡20min，打开流速阀， 用2mL离心管收集穿过液，每管1.0～1.5mL，减压浓缩去除洗脱液，获 得纯化后的蛋白，即为酰胺类化合物降解酶ACE123。所述结合液为25mL 的4M的NaCl水溶液，4mL的1M Tris水溶液（pH8）和1mL的1M的咪唑 水溶液，用去离子水定容到200mL配制而成。纯化后的蛋白SDS-PAGE 检测图见图4，表明E.coli BL21(DE3)/ace123菌株可以大量表达产生 ACE123蛋白。
实施例3酰胺类化合物降解酶ACE123对几种底物的降解情况
检测纯化的酰胺类化合物降解酶ACE123对对乙酰氨基酚（A）、2- 乙基-6甲基--N-乙氧基甲基-α-氯代乙酰替苯胺(B)、N-(3',4'-二氯苯基)丙酰 胺(C)或3-氯氨基甲酸异丙基酯(D)的活性。
在1mL PBS(pH=8)缓冲液的反应体系中，添加底物和实施例2方法制 备的酰胺类化合物降解酶ACE123，使得底物初始浓度为10mg/L，酶浓度 为1mg/L，37℃反应2h后，向反应液中加入200μL的6mol/L的盐酸水溶 液终止反应，然后乙酸乙酯萃取三次，取乙酸乙酯层用氮气吹干后以无水 甲醇定容至1ml，采用HPLC方法检测降解产物含量。HPLC检测条件： 流动相为V（CH3OH）︰V（H2O）=80︰20，分析柱为Grace Alltima C18 Column(4.6mm×250mm，5μm)，检测波长279nm，柱温30℃，流速 0.8mL/min，进样量20μL。
HPLC检测结果显示，ACE123对上述几种底物都具有降解活性（图 5），其中对乙酰氨基酚为最适降解底物，2h的降解率接近100%。几种 酰胺类化合物，均可以被ACE123断裂其酰胺键从而被降解，对2-乙基-6 甲基--N-乙氧基甲基-α-氯代乙酰替苯胺和N-(3',4'-二氯苯基)丙酰胺的降 解率达到39%和54%，对3-氯氨基甲酸异丙基酯的降解能力较弱。
上述实例为本发明较合理的实施方式，但本发明的实施方式不受上述 描述限制，凡是未背离本发明实质和原理所做的修改等，均在本发明的保 护范围之内。
