(一)技术领域
本发明涉及一株新型高效尼古丁降解菌——极小单胞菌 (Pusillimonas sp.)T2，及其在微生物降解尼古丁中的应用。
(二)背景技术
尼古丁(nicotine)，俗称烟碱，是一种由吡啶环和吡咯环共同组成的 胺类物质，分子式为C10H14N2，尼古丁由于N-甲基四氢吡咯在吡啶环上 的位置不同产生了α-烟碱、β-烟碱、γ-烟碱等立体异构体，在烟草中存在 的主要为β-烟碱，结构式分别如图8所示。纯净的尼古丁在常温下为无 色或淡黄色透明的油状液体，有强挥发性、特殊的辛辣味和潮解性，在阳 光下容易被氧化成暗灰色。在20℃时密度为1.0097g/mL，在760mm Hg 下沸点为274.5℃。尼古丁呈弱碱性，当温度低于60℃时，可以与水以任 意比例互溶，极易溶于醇、醚、氯仿等有机溶剂，粘在皮肤表面时，很容 易渗入体内而被机体吸收。
尼古丁是一种精神药品，具有与可卡因、海洛因一样的成瘾性，主要 以烟草及其废弃物、烟碱型农药、含尼古丁的药剂以及含尼古丁的橡胶等 多种形式广泛存在于环境中。尼古丁及其代谢产物具有诱发多种疾病、恶 化相关疾病症状、较强的致癌性、影响生物体的生殖和发育等生物毒性， 常常引发多种危害。目前，尼古丁的生物毒性已经引起了国内外学者的广 泛关注，并得到了多角度、多层次的研究。
较之物理、化学的方法去除烟草及其废弃物中的尼古丁，微生物法具 有操作简单、易改造等独特的优势，越来越受到人们的关注。早在20世 纪40年代，就已经有关于微生物降解尼古丁的报道。目前国内外的研究 者已经分离得到多株尼古丁降解菌，主要有：假单胞菌属、秸秆菌属、纤 维单胞菌属、苍白杆菌属、芽孢杆菌属等。这些微生物多数能利用尼古丁 为唯一碳源、氮源和能源进行生长，它们主要通过吡啶途径、吡咯途径、 吡啶和吡咯烷途径的交叉途径、脱甲基途径将尼古丁降解并为微生物的生 长提供碳源、氮源和能源，从而达到降解有毒废物的目的。
本发明从杭州庆丰农化有限公司采集的活性污泥中分离筛选得到一 株尼古丁高效降解菌，通过对其进行菌种鉴定和降解特性的研究，发现该 菌株可能存在全新的降解途径，这为更全面的了解尼古丁的降解途径提供 了依据，也为构建具有更高降解效率和能耐受更高尼古丁浓度的工程菌建 立了基础。
微生物是一类种类多、繁殖快、适应性强、代谢能力强的生物体。若 能筛选并分离出高效降解尼古丁的微生物，将尼古丁降解成对人体和环境 无毒害的物质，这对维护人类健康和生态安全有着深远的意义。
(三)发明内容
本发明目的是提供一株新型高效极小单胞菌属尼古丁降解菌—极小 单胞菌T2及其在降解尼古丁中的应用。
本发明采用的技术方案是：
极小单胞菌(Pusillimonas sp.)T2，保藏于中国典型培养物保藏中心， 地址：中国，武汉，武汉大学，邮编430072，保藏日期为2014年6月23 日，保藏编号为CCTCC No:M 2014272。
所述极小单胞菌T2的16S rDNA的Genbank登陆号为KM054873， 该菌株的主要生物学特征为：菌体杆状，端生鞭毛，无芽孢，大小约为 (0.5～1.0)×(1.5～2.0)μm，菌落平坦，中间凸起，边缘扩散，呈淡黄色， 革兰氏染色呈阴性，抗氨苄青霉素、卡那霉素，庆大霉素、氯霉素、链霉 素。该菌株最适宜的生长条件：pH值为7.0，温度30℃。该菌株经16S rDNA 序列分析鉴定为Pusillimonas属，因此命名为极小单胞菌(Pusillimonas sp.)T2。
本发明还涉及所述的极小单胞菌T2在微生物降解尼古丁中的应用。
具体的，所述的应用为：将极小单胞菌T2经发酵培养获得的含菌发 酵液离心，沉淀用pH值为7.0的磷酸缓冲液悬浮制成菌悬液作为酶源， 以尼古丁为底物，于无机盐培养基中，在25～45℃、pH值5.5～8.5、100～200 rpm、黑暗条件下进行降解反应，反应完全后(菌株活性增强后在10～16h 内即可使反应液中尼古丁的质量残留量小于0.1％)，获得尼古丁的质量残 留量小于0.1％的培养液，实现对尼古丁的降解。优选的，所述降解在30℃， pH 7.0、150rpm、黑暗条件下进行。
所述尼古丁终浓度为100～1500mg/L培养基(优选100mg/L)，所述 酶源用量以含菌细胞数计为2×106个/mL的培养基。
本发明所述酶源按如下步骤制备：
(1)斜面培养：将极小单胞菌T2接种于斜面培养基，20～40℃培养 3～5天，获得菌体斜面；所述斜面培养基的终浓度组成为：酵母粉10.0g/L， 蛋白胨5.0g/L，氯化钠10.0g/L，琼脂20.0g/L，溶剂为超纯水；
(2)种子培养：从步骤(1)菌体斜面上挑取一接种环菌体接种至无 机盐培养基中，25～40℃培养3～5天，获得种子液；所述每升无机盐培养 基组成为：NaCl 1g，K2HPO41.5g，KH2PO40.5g，(NH4)2SO41.5g，MgSO40.1g，1ml微量元素溶液，溶剂为超纯水，自然pH值，高压蒸汽灭菌(121℃， 20min)后制得，其中每升微量元素溶液组成为：MnSO4·H2O 0.13g，ZnCl20.23g，CuSO4·H2O 0.03g，CoCl2·6H2O 0.42g，Na2MoO4·2H2O 0.15g， AlCl3·6H2O 0.05g，溶剂为超纯水；
(3)发酵培养(扩大培养)：将步骤(2)获得的种子液以体积浓度 10～20％的接种量接种至LB液体培养基中，30℃、150rpm振荡培养至 OD600为0.15，获得发酵液，将发酵液离心，弃上清液，沉淀用pH值为 7.0的磷酸缓冲液悬浮制成菌悬液(获得含极小单胞菌T2的细胞悬液) 即为酶源，该菌悬液可投加于水体或土壤中用于尼古丁的降解；所述每升 LB液体培养基组成为：酵母粉10.0g，蛋白胨5.0g，氯化钠10.0g，溶剂 为超纯水，自然pH值。
本发明菌体生长量采用紫外分光光度计进行检测，通过测量菌体(即 含菌细胞培养液)在600nm处的吸光度值来表示。
本发明所述超纯水是指电阻率达到10MΩ*cm(25℃)的水。
本发明采用反相高效液相色谱法检测无机盐培养基中尼古丁的残留 量。反相高效液相色谱检测条件：流动相为甲醇：H2O＝10:90(体积比)， 分析柱为Grace Alltima C18色谱柱(4.6×250mm，5μm)，流速为0.8ml/min， 进样量为20μl，柱温为30℃。
与现有技术相比，本发明的有益效果主要体现在：
本发明所述极小单胞菌T2可通过直接投加的方式应用于水体和土壤 中尼古丁的降解，能安全、高效、快速的降解水体、土壤等物体上残留的 尼古丁，含有该菌株的菌剂制备工艺简单，成本低廉，使用方便，具有很 好的应用前景。
(四)附图说明
图1为本发明极小单胞菌T2的电镜图；
图2为尼古丁标准品浓度与峰面积的标准曲线图；
图3为本发明的极小单胞菌T2在纯培养条件下对浓度为100mg/L的 尼古丁的降解曲线图；
图4为本发明的极小单胞菌T2在尼古丁浓度为100mg/L纯培养条件 下的生长曲线图。
图5为温度对降解率的影响图。
图6为pH值对降解率的影响图。
图7为尼古丁初始浓度对降解率的影响图。
图8为尼古丁结构图。
(五)具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围 并不仅限于此：
实施例1：菌株的筛选与鉴定
1)培养基
无机盐培养基的配制：NaCl 1.0g，K2HPO41.5g，KH2PO40.5g，(NH4) 2SO41.5g，MgSO40.1g，1ml微量元素溶液，超纯水补足至1000ml，混 合后搅拌均匀，自然pH值，高压蒸汽灭菌(121℃，20min)后制得，其 中每升微量元素溶液中含MnSO4·H2O 0.13g，ZnCl20.23g，CuSO4·H2O 0.03g，CoCl2·6H2O 0.42g，Na2MoO4·2H2O 0.15g，AlCl3·6H2O 0.05g，用 超纯水定容至1000ml。
富集培养液：在无机盐培养基中加入尼古丁，使得尼古丁的终浓度为 100mg/L。
LB液体培养基的配制：酵母粉10g，蛋白胨5.0g，氯化钠10.0g，超 纯水定容至1000ml，混合后搅拌均匀，自然pH值，高压蒸汽灭菌(121℃， 20min)后制得。
LB固体培养基的配制：酵母粉10.0g，蛋白胨5.0g，氯化钠10.0g， 琼脂20.0g，超纯水定容至1000ml，混合后搅拌均匀，自然pH值，高压 蒸汽灭菌(121℃，20min)后制得。
2)菌株分离纯化
污泥样品采自杭州庆丰农化有限公司，取5ml污泥样品置于250ml 锥形瓶中，加入100ml富集培养液，黑暗振荡培养(30℃，150rpm)1 周，取5ml上层浊液于新鲜的富集培养液中，继续黑暗振荡培养(30℃， 150rpm)1周，重复上述操作过程3次，每次培养的接种物均取自于上次 培养所得的培养液。
取最后一次培养所得的培养液5ml进行梯度稀释((10-3、10-4、10-5、 10-6)，取各个稀释后的培养液100μl涂布于含100mg/L尼古丁的无机盐 固体培养基平板上，置于恒温培养箱(30℃，150rpm)中培养，待平板 上长出菌落后，挑取各菌落于含100mg/L尼古丁的LB固体培养基平板上 反复纯化，直至菌落单一，将纯化后的各菌落分别接至LB液体培养基试 管中振荡培养(30℃，150rpm)过夜，将培养好的菌液离心后接至富集 培养液中培养3d，通过反相高效液相色谱法检测各富集培养液中尼古丁 的残留量，最后筛选获得一株能高效降解尼古丁的菌株，记为菌株T2。
3)菌株鉴定
将上述获得的菌株T2进行形态特征和分子生物学鉴定，该菌株的电 镜照片如图1所示。该菌株的主要生物学特征为：菌体杆状，端生鞭毛， 无芽孢，大小约为(0.5～1.0)×(1.5～2.0)μm，菌落平坦，中间凸起，边缘 扩散，呈淡黄色，革兰氏染色呈阴性，抗氨苄青霉素、卡那霉素、庆大霉 素、氯霉素、链霉素。该菌株最适宜的生长条件：pH值为7.0，温度30℃。 该菌株经16S rDNA序列分析(Genbank登陆号为KM054873)鉴定为 Pusillimonas sp.属，因此命名为极小单胞菌(Pusillimonas sp.)T2，保藏 于中国典型培养物保藏中心，地址：中国，武汉，武汉大学，邮编430072， 保藏日期为2014年6月23日，保藏编号为CCTCC No:M 2014272。
实施例2：含菌细胞悬液的制备
(1)斜面培养：将极小单胞菌T2接种于斜面培养基，30℃培养3～5 天，获得菌体斜面；所述每升斜面培养基的终浓度组成为：酵母粉10.0g， 蛋白胨5.0g，氯化钠10.0g，琼脂20.0g，超纯水1000ml，自然pH；
(2)种子培养：从步骤(1)菌体斜面上挑取一接种环菌体接种至无 机盐培养基中，30℃培养3～5天，获得种子液；所述无机盐培养基终浓 度组成同实施例1；
(3)扩大培养：将步骤(2)获得的种子液以体积浓度20％的接种 量接种至LB液体培养基(100ml)中，30℃、150rpm振荡培养至OD600 为0.1～0.15，获得菌液，将菌液离心(6000rpm，5min)，弃上清，沉淀用 pH值为7.0的磷酸缓冲液悬浮，获得含极小单胞菌T2细胞悬液100mL， 其中细胞悬液中的极小单胞菌T2浓度为4×107个/ml；所述LB液体培养 基终浓度组成同实施例1；pH值为7.0的0.2mol/L的磷酸缓冲液的配方 为：取0.2mol/L的磷酸二氢钠39ml和0.2mol/L的磷酸氢二钠61ml，用 超纯水定容至1000ml，高压蒸汽灭菌(121℃、20min)后即得。
实施例3：对尼古丁的降解实验
1)无机盐培养基中菌体浓度与尼古丁含量的检测：
菌体生长量采用紫外分光光度计来检测，通过测量培养液中菌体在 600nm处的吸光度值来表示。
本实验采用反相高效液相色谱法检测无机盐培养基中尼古丁的残留 量，根据尼古丁标准曲线计算出待测培养基中尼古丁的含量。反相高效液 相色谱检测条件：流动相为甲醇：H2O＝10:90(体积比)，分析柱为Grace Alltima C18色谱柱(4.6×250mm，5μm)，流速为0.8ml/min，进样量为20μl， 柱温为30℃。
将尼古丁标准品用无菌水溶解，在反相液相色谱测试标准曲线，尼古 丁标准曲线如图2所示，标准曲线方程为y＝20342x+1.6E+5，R2＝0.9989， y为峰面积，x为尼古丁浓度，mg/L)。
2)尼古丁降解实验：
a、取4个250ml锥形瓶，分别加入100ml无机盐培养基，高压蒸汽 灭菌(121℃，20min)后加入尼古丁，使尼古丁终浓度均为100mg/L， 各取实施例2方法获得的含极小单胞菌T2细胞悬液5ml，分别接种于此 无机盐培养基中，使极小单胞菌T2终浓度为2×106个/ml无机盐培养基， 分别于25，30，35，40℃培养摇床(pH值为7.0，150rpm，黑暗)，每 隔一定时间取样测定残留尼古丁浓度，实验发现，在一定温度范围内，培 养基中尼古丁的残留浓度随着时间的延长而逐渐降低。在时间为10h～15h 范围内，尼古丁的降解速率最大，30℃左右为最佳降解温度，结果见图5 所示。
b、取6个250ml锥形瓶，分别加入100ml无机盐培养基，高压蒸汽 灭菌(121℃，20min)后加入尼古丁，使尼古丁终浓度均为100mg/L，各 取实施例2方法获得的含极小单胞菌T2细胞悬液5ml，分别接种于此无 机盐培养基中，使极小单胞菌T2终浓度为2×106个/ml无机盐培养基，分 别调节培养基pH 5.5，6.5，7.0，7.5，8.0，8.5，摇床培养(30℃，150rpm， 黑暗)，每隔一定时间取样测定残留尼古丁浓度，实验表明，pH值过高或 过低均对菌株的降解效率有影响，最适pH值为7.0，结果见图6所示。
c、取3个250ml锥形瓶，均加入100ml无机盐培养基，高压蒸汽灭 菌(121℃，20min)后加入尼古丁，使尼古丁终浓度均为100mg/L，各取 实施例2方法获得的含极小单胞菌T2细胞悬液5ml，分别接种于此无机 盐培养基中，使极小单胞菌T2终浓度为2×106个/ml无机盐培养基，相应 的设置3个不含该菌种的实验作为空白对照，然后一同置于摇床(30℃， pH值为7.0，150rpm，黑暗)中黑暗振荡培养。在培养期间每隔一定时 间取样，根据上述检测方法来检测无机盐培养基中菌体的生长量与尼古丁 的残留量，结果见图3、图4所示。
本发明菌株对100mg/L浓度的尼古丁的降解曲线如图3所示，菌体 的生长曲线如图4所示，图4可以看出OD600从0.07增加到0.18，说明 菌体生长良好，观察图3，可以发现，培养14h后，本发明的尼古丁降解 菌对100mg/L的尼古丁的降解率接近为100％，反应液中尼古丁的质量残 留量为0，并且所有未加菌的空白对照在22h后的水解率均小于5％。
d、取5个250ml锥形瓶，分别加入100ml无机盐培养基，高压蒸汽 灭菌(121℃，20min)后加入尼古丁，使尼古丁终浓度分别为100mg/L、 200mg/L、500mg/L、1000mg/L和1500mg/L，各取实施例2方法获得的 含极小单胞菌T2细胞悬液5ml，分别接种于此无机盐培养基中，使极小 单胞菌T2终浓度为2×106个/ml无机盐培养基，分别调节培养基pH 7.0， 摇床培养(30℃，150rpm，黑暗)，每隔一定时间取样测定残留尼古丁浓 度，结果见图7所示。
实验结果表明该菌种对中、高浓度(见图7)的尼古丁具有非常好的 降解能力，但尼古丁浓度高于1500mg/L时，尼古丁的降解能力显著下降， 且降解周期较长，而且此菌种为新型尼古丁降解菌，因此，该菌对研究尼 古丁的降解途径与降解基因具有非常大的促进作用，对环境中尼古丁的降 解尤其是对尼古丁的集中修复具有较大的积极意义。
实施例4尼古丁降解
取250ml锥形瓶，加入100ml无机盐培养基，高压蒸汽灭菌(121℃， 20min)后加入尼古丁，使尼古丁终浓度分别为100mg/L，取实施例2方 法获得的含极小单胞菌T2细胞悬液5ml，接种于此无机盐培养基中，使 极小单胞菌T2终浓度为2×106个/ml无机盐培养基，调节培养基pH 7.0， 摇床培养(30℃，150rpm，黑暗)15h，取培养液测定残留尼古丁浓度为 0.09mg/L，结果表明尼古丁质量残留量为0.09％。
