约翰逊不动杆菌AJ-3菌株及其用途

技术领域

本发明属于环境微生物领域，具体涉及一株约翰逊不动杆菌（Acinetobacter johnsonii）AJ-3菌株的分离、培养及其在污水除磷中的应用，应用于城市污水处理厂的生物除磷。

背景技术

从2010年到2012年中国环境状况公报显示，62个国家控制重点湖泊（水库）水体富营养化问题突出，东海近岸海域水质近三年来均为极差且重度污染，主要污染指标中均包含磷；而富营养化将会降低水体的透明度，产生有害气体和生物毒素，影响人畜的健康，破坏水体中生物多样性，影响旅游和航运等；因此，将水体中的磷去除对防止水体富营养化尤为重要。

目前水体除磷技术主要分两类：化学除磷和生物除磷。化学除磷主要为化学沉淀法，具有操作简单、去除率高、运行稳定等优点；但该法存在投药量大、处理费用高、产生的化学污泥量大且富含有机质，以及化学污泥的最终处置也是一个问题。生物除磷主要是利用聚磷菌对磷的富集作用，通过排除剩余富磷污泥的方式有效地去除水体中的磷，生物除磷具有产泥量少、节约能源、运行费用较低、无二次污染等优点，是目前应用较多的除磷方法。大规模污水处理厂常用的污水除磷方法主要是生物除磷法，其中生物强化除磷法（Enhanced Biological Phosphorus Removal，EBPR）具有污泥产量少，不使用化学物质和运行经济等特征。

聚磷菌（Phosphorus Accumulataing Organisms，PAOs）不是细菌分类学中的概念，只是对具有“超量吸磷”特征的一类微生物的总称。所谓“超量吸磷”，是指它们可以把多余的磷以多聚磷酸盐的形式储藏在体内，以备在不良环境中提供能量与营养。所以有些聚磷菌菌体的磷含量可达干重的 10%以上。而且，因为在“超量吸磷”的过程中可以使外界环境中的磷含量明显减少，聚磷菌就成为了污水生物除磷的主要执行者，在生物除磷中起决定性作用。

本发明从自然生境中筛到一株选具有典型厌氧特性的聚磷菌约翰逊不动杆菌（Acinetobacter johnsonii）AJ-3菌株，旨在丰富的聚磷菌资源，扩大聚磷菌菌种库，为工业废水、污水生物除磷提供菌种。

发明内容

本发明的目的是提供一株高效聚磷菌约翰逊不动杆菌及其应用。

本发明所述约翰逊不动杆菌（Acinetobacter johnsonii）AJ-3菌株，保藏编号为；CCTCC M 2014023，保藏地为：中国典型培养物保藏中心，保藏日为：2014年01月16日。

本发明所涉及的菌株筛选自浙江省金华市浙江师范大学北门的土壤样品。采用梯度稀释法获得纯菌株，根据形态特征、生理生化特征、16S rDNA基因序列鉴定AJ-3菌株为约翰逊不动杆菌（Acinetobacter johnsonii）。

AJ-3菌株菌落圆形、白色、边缘整齐、隆起、光滑湿润、半透明（附图1）；菌体呈短杆状，革兰氏染色阴性，无鞭毛，无芽孢（附图2）。

AJ-3菌株能水解淀粉、硝酸盐还原和L-精氨酸脱羧酶试验均呈阳性，不能利用柠檬酸盐，不液化明胶，VP、甲基红、吲哚、硫化氢、葡萄糖发酵试验均为阴性（表1）；菌株生长温度范围为15 ℃~40 ℃，最适生长温度为28 ℃，适宜生长pH为7.0~8.0。

16S rDNA测序分析结果表明，其碱基序列全长为1431 bp（附图3），与约翰逊不动杆菌（Acinetobacter johnsonii）的同源性为98% （附图4）。

本发明所涉及的AJ-3菌株可用于合成污水的生物除磷的条件如下：取保存于-20℃的甘油菌20 μL涂布于牛肉膏蛋白胨固体培养基的平板上，28 ℃培养24 h后挑单菌落于0.3 mL无菌水混匀，取100 μL涂布于牛肉膏蛋白胨固体培养基的平板上，用打孔器（孔径0.5 cm）取2孔接到15 mL牛肉膏蛋白胨液体培养基中，置于28 ℃，170 r/min摇床中培养24 h（OD₆₀₀≈0.9）活化，作种子液；再以8 %的接种量接入合成污水液体培养基，在温度28 ℃，摇床速度170 r/min，起始pH为7.2的条件下培养9 h。取50 mL菌悬液于50 mL的离心管中，以12000 r/min离心5 min，取上清液按总磷的测定方法测磷浓度，总磷的测定采用钼酸铵分光光度法，根据对照计算除磷率，获得最高除磷率为60.1%（附图6）。

本发明为一株约翰逊不动杆菌（Acinetobacter johnsonii） AJ-3菌株，该菌株生长快速，环境适应能力强，对溶氧要求低，可以在含磷的合成污水液体培养基中快速生长，并将磷去除，除磷效率高而稳定，达55%~60.1%，无二次污染。因此，AJ-3菌株可应用于含磷的污水处理，是水体生物除磷工艺上重要的微生物资源，具有良好的应用前景。

附图说明

图1 为AJ-3菌株的菌落特征。

图2为 AJ-3菌株的菌体形态（×1000）。

图3为AJ-3菌株16S rDNA基因序列。

图4 为基于16s rDNA基因序列建立的不动杆菌属系统发育树。

图5 为AJ-3菌株的生长曲线。

图6 为装液量对AJ-3菌株除磷率的影响。

生物保藏声明

约翰逊不动杆菌（Acinetobacter johnsonii）AJ-3菌株，保藏编号为；CCTCC M 2014023，保藏地为：中国典型培养物保藏中心，保藏日为：2014年01月16日。

具体实施方式

实施例1 高效聚磷菌约翰逊不动杆菌AJ-3菌株的分离筛选和鉴定

（一）培养基

牛肉膏蛋白胨固体培养基：牛肉膏3 g/L、蛋白胨10 g/L、NaCl 5 g/L、琼脂20 g/L，pH 7.0-7.2 （液体培养基不加琼脂）；

限磷（富磷）固体培养基：取30 mL去离子水溶解8.372 g 3-吗啉丙磺酸、0.717g N-三（羟甲基）甲基甘氨酸，用10 mol/L的KOH调节pH至7.4，按下列顺序加溶液：0.01 mL 1.830% FeSO₄溶液（现配）、5 mL 1.9 mol/L NH₄Cl、1 mL 0.276 mol/L K₂SO₄、0.025 mL 0.02 mol/L  CaCl₂·2H₂O、0.42 mL 1.25 mol/L MgCl₂·6 H₂O、20 mL 2.5 mol/L NaCl、0.02 mL 微量元素混合液（七钼酸铵3×10^-6 mol/L、H₃BO₃ 4×10^-4 mol/L、CoCl₂ 3×10^-5 mol/L、CuSO₄ 10^-5 mol/L、MnCl₂ 8×10^-5 mol/L、ZnSO₄ 10^-5 mol/L）、10 mL 1%葡萄糖、0.4 mL 1.686%维生素B1、250 μL 6.928% K₂HPO₄（富磷加5 mL）_、50 mg对甲苯胺蓝，加水定容至500 mL，过滤除菌后与已灭菌处理的溶有20 g琼脂且未凝固的500 mL溶液混匀制成固体培养基。

（二）方法

采用梯度稀释分离法。取土样1.0 g，加9 mL无菌水稀释，进行10^-1~10^-6梯度稀释，取10^-5稀释液100 μL涂布于牛肉膏蛋白胨固体培养基平板上，28 ℃培养24 h。挑取细菌单菌落，进行分离、纯化；进一步纯化菌株采用划线法，所得纯菌株置-20℃冰箱中保存，备用。

用吕氏美兰染色法、苏丹黑染色法、蓝白斑法和钼酸铵分光光度法对菌株进行筛选，经初筛和复筛后获一株编号为AJ-3高效除磷的细菌菌株（附图2）。

对AJ-3菌株进行形态学、生理生化和16S r DNA序列鉴定。

（三）结果

菌株形态特征：菌落圆形、白色、边缘整齐、隆起、光滑湿润、半透明（附图1）；菌体呈短杆状，革兰氏染色呈阴性，无鞭毛，无芽孢（附图2）。

菌株生理生化特征：AJ-3菌株能水解淀粉、硝酸盐还原和L-精氨酸脱羧酶试验均呈阳性，不能利用柠檬酸盐，不液化明胶，VP、甲基红、吲哚、硫化氢、葡萄糖发酵试验均为阴性（表1）；菌株生长温度范围为15 ℃~40 ℃，最适生长温度为28 ℃，适宜生长pH为7.0~8.0。

16S rDNA基因序列（附图3）：16S rDNA基因测序分析结果表明，其碱基序列全长为1431 bp，运用在线Blast软件进行同源性分析，选取21株不动杆菌属的菌株构建系统发育树（附图4）。由图4显示，AJ-3菌株与约翰逊不动杆菌（Acinetobacter johnsonii）在进化树的同一支上，两菌株同源性最高达98%。结合菌株形态特征、生理生化特征，鉴定该菌株为约翰逊不动杆菌（Acinetobacter johnsonii）。 

   表1 AJ-3菌株的生理生化试验结果

注：“+”为阳性，“-”为阴性。

实施例2 约翰逊不动杆菌AJ-3菌株的生长曲线测定

（一）菌株：AJ-3菌株。

（二）培养基

牛肉膏蛋白胨固体培养基：配方同实施例1

合成污水液体培养基：乙酸钠0.925 g/L、蛋白胨0.1 g/L、酵母膏0.01 g/L、NaCl 0.05 g/L、KH₂PO₄ 0.0655 g/L、MgCl₂·6H₂O 0.1412 g/L、CaCl₂ 0.025 g/L，pH7.0-7.2。

（三）方法

    取保存于-20℃的甘油菌20 μL涂布于牛肉膏蛋白胨固体培养基的平板上，28 ℃培养24 h后挑单菌落于0.3 mL无菌水混匀，取100 μL涂布于牛肉膏蛋白胨固体培养基的平板上，用打孔器（孔径0.5 cm）取2孔接到15 mL牛肉膏蛋白胨液体培养基中，置于28 ℃，170 r/min摇床中培养24 h（OD₆₀₀≈0.9）活化，作种子液；再以8%的接种量接入装有100 mL合成污水液体培养基的250 mL锥形瓶中，置于28 ℃，170 r/min摇床中培养，每隔1 h测定OD₆₀₀值。

（四）   结果

AJ-3菌株经活化后在合成污水培养基中生长快速，适应能力强；在培养过程中未出现明显的迟缓期，1 h~9 h为对数期生长期，9 h~24 h一直处于稳定生长期（附图5）。

实施例3 装液量对约翰逊不动杆菌AJ-3菌株生物除磷效果的影响。

（一）菌株：AJ-3菌株。

（二）培养基

牛肉膏蛋白胨固体培养基：配方同实施例1；

合成污水液体培养基：配方同实施例2。

（三）方法

取保存于-20℃的甘油菌20 μL涂布于牛肉膏蛋白胨固体培养基的平板上，28 ℃培养24 h后挑单菌落于0.3 mL无菌水混匀，取100 μL涂布于牛肉膏蛋白胨固体培养基的平板上，用打孔器（孔径0.5 cm）取2孔接到15 mL牛肉膏蛋白胨液体培养基中，置于28 ℃，170 r/min摇床中培养24 h（OD₆₀₀≈0.9）活化，作种子液；再以8%的接种量接入装有不同量的合成污水液体培养基（装液量分别为40 mL、80 mL、100 mL、120 mL、150 mL、200 mL）250 mL三角瓶中，在温度28 ℃，摇床速度170 r/min，起始pH为7.2的条件下培养9 h。取25 mL菌悬液于50 mL的离心管中，以12 000 r/min离心5 min，取上清液按总磷的测定方法测磷浓度，总磷的测定采用钼酸铵分光光度法，根据对照计算除磷率。

（四）   结果

不同装液量对AJ-3菌株除磷效果有一定的影响，当装液量为250 mL三角瓶中装120 mL，温度28 ℃、摇床速度170 r/min，合成污水液体培养基（pH为7.2）下培养9 h，除磷率可达60.1%；AJ-3菌株适宜装液量为80 mL~150 mL （附图6）。